Neurosféra - Neurosphere

Neurální progenitorové buňky: Po vytvoření neurosféry se embryonální nervové progenitorové buňky rozšířily do monovrstvy. A. Neurosféra skládající se z SVZ buňky izolované na E15, které agregovaly v suspenzi po 2 dnech kultivace. Měřítko: 100 µm. B. Neurosféra buněk SVZ odvozených od E15, která se po 4 dnech kultivace připojila k dnu kultivační baňky. Všimněte si buněk migrujících pryč z neurosféry. Měřítko: 100 µm. C. Pro elektrofyziologický záznam byly vybrány buňky na periferii neurosfér. Většina zaznamenaných buněk rozšířila procesy. Šipky označují umístění pipet pro nahrávání (vlevo) a puffer (vpravo). Měřítko: 20 um. Smith DO a kol., PLOS ONE, 2008

A neurosféra je systém kultury složený z volně plovoucích shluků nervové kmenové buňky. Neurosféry poskytují metodu vyšetřování buněk nervových prekurzorů in vitro. Domnělé neurální kmenové buňky jsou suspendovány v médiu bez adherentních substrátů, které však obsahuje nezbytné růstové faktory, jako je např epidermální růstový faktor a fibroblastový růstový faktor. To umožňuje, aby se neurální kmenové buňky formovaly do charakteristických 3-D shluků. Neurosféry však nejsou totožné s kmenovými buňkami; spíše obsahují pouze malé procento nervových kmenových buněk.[1]

Převládající využití neurosféry je v neurosféře test. Avšak prostředí in vitro a in vivo ukázalo, že mají různé indukční účinky na prekurzorové buňky. Vytvoření testu neurosféry je vysoce citlivé; stále není jasné, jaké jsou přesně odlišné účinky, které má prostředí v porovnání s in vivo životní prostředí.[1]

Dějiny

Reynolds a Weiss poprvé popsali metodu neurosféry zkoumání neurálních prekurzorových buněk v roce 1992. Metoda pokračovala prací Angela Viscovi a Dereka van der Kooye a kolegů.[1]

Reynolds a Weiss

V roce 1992 Brent A. Reynolds a Samuel Weiss se pokusil izolovat buňky reagující na EGF od dospělé myši centrální nervový systém (CNS). Odpojili striata 3 až 18 měsíců starých myší pomocí enzymů a naočkovalo je do bezsérové ​​kultury obsahující 20 ng EGF na mililitr. Po dvou dnech in vitro většina buněk zemřela, ale 15 ± 2 buňky pro každou destičku procházely buněčným dělením. To pokračovalo dva až tři dny, poté se proliferující shluky buněk oddělily a vytvořily sféru proliferujících buněk. Po tomto objevu sférické formace buněk oba vyhodnotili antigenní vlastnosti buněk v těchto sférách. Zjistili, že buňky ve sférách jsou téměř všechny imunoreaktivní nestin, střední vlákno nalezené v neuroepiteliální kmenové buňky. Buňky nebyly imunoreaktivní neurofilament, neuron-specifická enoláza (NSE), a gliální fibrilární kyselý protein (GFAP). Po další proliferaci a delších dnech in vitro v přítomnosti EGF se buňky nakonec staly imunoreaktivními vůči neurofilamentům, NSE a GFAP. Buňky, které měly tuto imunoreaktivitu, byly poté testovány na CNS neurotransmitery s nepřímým imunocytochemie. Reynolds a Weiss zjistili, že po 21 dnech obsahovaly in vitro kultury sfér a přidružených buněk dva hlavní neurotransmitery dospělého striata. Tyto sféry buněk, které Reynolds a Weiss objevili v roce 1992, byly prvními formacemi neurosféry vytvořenými a analyzovanými.[2]

Stanovení neurosféry (kmene)

Test neurosféry zkoumá tři základní charakteristiky nervových kmenových buněk: proliferaci, sebeobnovení, a multipotence.[3] Samoobnovení a multipotence jsou požadavky, aby buňky byly považovány za kmenové buňky. The test neurosféry, nebo stanovení stopky, byl použit k potvrzení, že neurosféry obsahují nervové kmenové buňky. Neurosféry jsou disociovány a distribuovány do jednobuněčných jamek, aby se prozkoumala jejich vlastní obnova pomocí klonální analýzy. Malé procento buněk se reformuje na sekundární neurosféru. Sekundární neurosféry jsou poté přeneseny do kultivačního média obsahujícího růstové faktory, které podporují buněčnou diferenciaci. Přítomnost různých typů buněk, včetně neurony, astrocyty, a oligodendrocyty, potvrzuje multipotenciál těchto prekurzorových buněk. Důkaz sebeobnovy a multipotence slouží k potvrzení přítomnosti nervových kmenových buněk v neurosférách a zdůrazňuje, že nervové kmenové buňky tvoří pouze zlomek neurosféry.[1]

Klinické aplikace

Vzhledem k tomu, že cílem testu neurosféry je vývoj nervových kmenových buněk in vitro, mohou být klinické aplikace takového úspěchu vysoce přínosné. Neuronové kmenové buňky, které jsou transplantovány, jsou schopné procházet hematoencefalická bariéra a integrují se do mozku hostitele bez narušení normální funkce. Tato terapeutická aplikace nervových kmenových buněk pocházejících z neurosfér je s ohledem na účinnost stále v plenkách, ale má vysoký potenciál pro úspěch při léčbě mnoha nemocí.

Dalším aspektem klinických aplikací týkajících se nervových kmenových buněk je univerzálnost. Došlo k transplantaci nervových kmenových buněk do různých tkání s úspěšnou diferenciací a proliferací v těchto tkáních. Toto širší diferenciační „spektrum“ by bylo v klinickém prostředí vysoce využitelné.[4]

Neurosféry byly také použity pro regeneraci periferních nervů [5]

Sluchová obnova

Vědci zkoumají využití nervových kmenových buněk (NSC) získaných z neurosfér k podpoře opětovného růstu neuronů a vlasových buněk vnitřního ucha. Hu a kol. transplantovaly dospělé myši NSC do normálních a hluchých vnitřních uší morčat. Před implantací byly NSC ošetřeny neurogenin 2 protein na podporu množení zamýšlených buněk vnitřního ucha. Dospěli k závěru, že dospělí NSC byli skutečně schopni přežít a rozlišovat se ve zraněném vnitřním uchu a že tento typ terapie by mohl působit k obnovení sluchové funkce u subjektů se sluchovým postižením. Tento experiment také naznačuje, že genetické inženýrství může přispět k úspěchu generování specifických progenitorových buněk, které nás zajímají.[6]

Omezení

Jakkoli byla kultura neurosféry užitečná pro biologické studie vývojových procesů a funkční test pro testování neuronových charakteristik, existuje několik omezení metody.

Za prvé, tvorba kultury neurosféry je velmi citlivá na postup, protože její vytvoření závisí na systému použitém k vytvoření kultury. Rozdíly v hustotě buněk, různých složkách nebo koncentracích faktorů v médiu a metodě, metodě a frekvenci pasážování a zda je neurosféra disociována před diferenciací, může vést k rozdílům ve složení typů buněk a vlastnostech v každé neurosféře. To představuje problém pro konsolidaci a interpretaci dat, a to i v rámci stejné studie.

Další problém se systémem vyplývá z povahy suspenzních kultur (in vitro): jednotlivé buňky nelze snadno pečlivě sledovat. Jelikož se neuronová kapacita buněk rozšířených v neurosféře snižuje po větším počtu průchodů, nedostatek monitorování přidává neurosférické metodě další složitost.

A konečně, jen malé procento buněk v každé heterogenní sféře má potenciál tvořit neurosféry a ještě méně buněk skutečně splňuje kritéria pro to, aby byly neurálními kmenovými buňkami. Neurosféry obsahují buňky v různých fázích diferenciace, včetně kmenových buněk, které se množí nervové progenitorové buňky, postmitotické neurony a glia. Kromě toho se heterogenita neurosféry zvyšuje s její velikostí, protože s delší dobou v kultuře vzniká více a rozmanitých typů buněk.[7]

Viz také

Reference

  1. ^ A b C d Kempermann, Gerd. Neurogeneze dospělých. Oxford University Press, 2006, str. 66-78. ISBN  978-0-19-517971-2
  2. ^ Reynolds, Brent A .; Samuel Weiss (27. března 1992). "Generace neuronů a astrocytů z izolovaných buněk dospělého savčího centrálního nervového systému". Věda. Nová řada. 255 (5052): 1707–1710. doi:10.1126 / science.1553558. JSTOR  2876641. PMID  1553558.
  3. ^ http://www.med.nyu.edu/fishelllab/pdfs/review9.pdf
  4. ^ Deleyrolle, Loic P .; Rodney L. Rietze; Brent A. Reynolds (16. listopadu 2007). „Test neurosféry, zkoumaná metoda“. Acta Neuropsychiatrica. 20 (1): 2–8. doi:10.1111 / j.1601-5215.2007.00251.x. PMID  26953088.
  5. ^ Uemura T, Takamatsu K, Ikeda M, Okada M, Kazuki K, Ikada Y, Nakamura H (2012). „Transplantace indukovaných neurosfér odvozených z pluripotentních kmenových buněk pro opravu periferních nervů“. Biochem. Biophys. Res. Commun. 419 (1): 130–5. doi:10.1016 / j.bbrc.2012.01.154. PMID  22333572.
  6. ^ Hu Z, Wei D, Johansson CB, Holmström N, Duan M, Frisén J, Ulfendahl M (2005). "Přežití a neurální diferenciace dospělých nervových kmenových buněk transplantovaných do zralého vnitřního ucha". Experimentální výzkum buněk. 302 (1): 40–47. doi:10.1016 / j.yexcr.2004.08.023. PMID  15541724.
  7. ^ Jensen, Josephine B .; Malin Parmar (2006). „Silné stránky a omezení systému kultury neurosféry“. Molekulární neurobiologie. 34 (3): 153–162. doi:10,1385 / mn: 34: 3: 153. PMID  17308349.

externí odkazy