Izotopová analýza nukleární magnetickou rezonancí - Isotopic analysis by nuclear magnetic resonance

Izotopová analýza nukleární magnetickou rezonancí umožňuje uživateli s velkou přesností kvantifikovat rozdíly izotopového obsahu na každém místě a molekula a tedy měřit konkrétní přírodní izotopová frakcionace pro každé místo této molekuly. The SNIF-NMR byla vyvinuta analytická metoda k detekci (nad) cukrování vína a obohacení vína hroznové mušty, a používá se hlavně ke kontrole pravosti potravin (např vína, duchové, ovocný džus, Miláček, cukr a ocet ) a ke kontrole přirozenosti některých aromatických molekul (např vanilin, benzaldehyd, malinový keton a anetol ). Metodu SNIF-NMR přijala Mezinárodní organizace pro révu a víno (OIV) a Evropská unie jako oficiální metoda pro analýzu vína. Je to také oficiální metoda přijatá Asociace analytických chemiků (AOAC) pro analýzu ovocných šťáv, javorový sirup, vanilin, a Evropský výbor pro normalizaci (CEN) pro ocet.

Pozadí

  • 1981: Vynález metody SNIF-NMR profesorem Gerardem Martinem, Maryvonne Martin a jejich týmem z University of Nantes / CNRS [1]
  • 1987: Vytvoření Eurofiny Nantes Laboratories - specializující se na analýzu vín a nákup provozování patentových práv CNRS[1] (tento patent je nyní veřejný a název „SNIF-NMR“ je nyní registrovaný ochranná známka[2]

OIV to přijímá jako oficiální metodu

  • 1987-1990: Eurofins Laboratories používají metodu SNIF-NMR k analýze ovocných šťáv a některých přírodních látek příchutě
  • 1990: Metoda SNIF-NMR je Evropskou unií uznána jako oficiální metoda pro analýzu vín[3]
SNIF-NMR ve světě

→ Implementace metody SNIF-NMR pro oficiální laboratoře v Evropě

  • 1990-1992: metoda je testována na aromatických molekulách
  • 1996: Metodu SNIF-NMR uznává ve Spojených státech AOAC pro ovocné šťávy[4]

→ Implementace metody SNIF-NMR

→ Implementace metody SNIF-NMR pro oficiální laboratoře v Asii

Zásada

Izotopová distribuce

Obrázek 2
Obrázek 3 - Zdroje izotopové frakcionace

Atomy vodík, kyslík, a uhlík koexistují přirozeně v určitých poměrech s jejich stabilní izotopy, 2H (nebo D), 18O a 13C, v různých poměrech, jak je znázorněno na obrázku 2 níže.

Množství a distribuce různých izotopů v molekule je ovlivněna:

  • Environmentální (klimatické a geografické) podmínky - pro přírodní produkty
  • Chemické nebo biochemické procesy, jako je fotosyntetický metabolismus v rostlinách

Tento jev je známý jako přirozený izotopová frakcionace (viz obrázek 3). Výsledný izotopový otisk prstu může poskytnout informace o původu - botanickém, syntetickém, zeměpisném - původu molekuly nebo produktu.

Obecná zásada

Princip SNIF-NMR je postaven na: „Přírodní izotopové frakcionaci“. Z důvodu autenticity potravin se běžně používají dvě jádra:

  • Vodíková jádra: 2Metoda H-SNIF-NMR byla počáteční aplikací SNIF-NMR, měří poměr deuterium / vodík na každém místě molekuly vzorku
  • Uhlíková jádra: 13Metoda C-SNIF-NMR otevřela nové možnosti analýzy pomocí SNIF-NMR (nové molekuly a nové aplikace). Tato metoda použije poměry 13Pokrýt 12C na každém místě molekuly

Kroky metody

Obrázek 5 - Kroky SNIF-NMR ethanolu - oficiální metoda

SNIF-NMR se aplikuje na čisté (nebo vyčištěné) molekuly. Proto mohou být v laboratoři před analýzou vyžadovány některé kroky přípravy, například pro SNIF-NMR ethanolu podle oficiálních metod:

  • Kvašení (pro ovocný džus)
  • Kvantitativní extrakce ethanol podle destilace
  • Standardizovaná příprava NMR Vzorky
  • Získání NMR
  • Interpretace výsledků a zpráva o pravosti

V každém kroku analýzy SNIF-NMR by mělo být vyvinuto úsilí, aby se zabránilo izotopové frakcionaci parazitů. U každého vzorku se provádějí kontrolní opatření, jako je stanovení obsahu alkoholu meziproduktů analýzy (fermentovaná šťáva nebo destilát).

Výhody metody

Obrázek 6 - Princip IRMS

Izotopové poměry molekuly lze také určit pomocí hmotnostní spektrometrie s poměrem izotopů (IRMS), množství vzorku pro IRMS je mnohem nižší než pro NMR a existuje možnost připojení hmotnostního spektrometru k chromatografickému systému, aby bylo možné on-line čištění nebo analýzy několika složek komplexní směsi. Vzorek je však spálen po fyzické transformaci, jako je spalování nebo pyrolýza. Proto poskytuje střední hodnotu koncentrace studovaného izotopu mezi všemi místy molekuly. IRMS je oficiální technika AOAC používaná pro průměrný poměr 13C/12C (nebo 513C) ze dne cukry nebo ethanol a oficiální metoda CEN a OIV pro 18O / 16O v voda.

Metoda SNIF-NMR (Site-specific Natural Isotope Fractionation studovaná pomocí nukleární magnetické rezonance) je schopna určit s vysokou mírou přesnosti izotopové poměry pro každé z míst molekuly, což umožňuje lepší diskriminaci. Například pro ethanol (CH3CH2OH), tři poměry ((D / H) CH3, (D / H) CH2 a (D / H)ACH) lze získat.

Příklady aplikací 2H-SNIF-NMR

Obrázek 7 - Uznání oficiální metody izotopu pro použití v potravinách - 2013

Aplikace na ovocné šťávy a javorový sirup

Oficiální metoda AOAC pro zjišťování přidání cukru do ovocné šťávy[4] nebo v javorovém sirupu. Je to jediná spolehlivá metoda pro detekci přidání cukru C3 (např .: řepný cukr ).

NMR spektrum (příklad 2H-SNIF-NMR)

Obrázek 8 - 2H-NMR spektrum ethanolu

Molekuly ethanolu získané po úplné fermentaci cukru koexistují se 3 přirozeně monodeuterovanými izotopomery (CH2D-CH2-OH, CH3-CHDOH a -CH3-CH2OD). Jejich přítomnost pak lze s relativní přesností kvantifikovat.[5]

K následujícímu 2H-NMR spektrum (obrázek 8), pík odpovídá jednomu ze tří pozorovaných izotopomerů ethanolu. V oficiální metodě AOAC jsou poměry (D / H) CH3 a (D / H) CH2 jsou počítány porovnáním s interním standardem, tetramethylmočovina (TMU) s certifikovanou (D / H) hodnotou.

Interpretace izotopových hodnot SNIF-NMR

Obrázek 9 - Falšovací trojúhelník: rozdělení izotopových poměrů na molekuly ethanolu

Následující obrázek 9 shrnuje princip interpretace:

  • Výsledky měřené pomocí IRMS (izotopová odchylka δ 13C), což umožňuje diskriminaci rostlin podle jejich CO2 fotosyntetický metabolismus (C4 jako plechovka nebo kukuřice proti C3 jako řepa, pomeranč nebo hroznový)
  • S výsledky měřenými pomocí SNIF-NMR ((D / H) I), které mohou odlišit botanický původ cukrů ve stejné metabolické skupině (řepa versus pomeranč nebo hroznový)

Hodnoty získané na zkušebním vzorku jsou poté porovnány s hodnotami autentických vzorků (databáze).

Žádost o pravost vín

Obrázek 10 - Aplikace SNIF-NMR a IRMS na pravost vína

SNIF-NMR je oficiální metoda OIV k určení autentizace původu vína. Je to jediná metoda k detekci přidání cukru C3 (jako řepný cukr).

Izotopové parametry vody i ethanolu se vztahují k vlhkost vzduchu a teplota rostoucí oblasti rostlina. Proto je při stanovení diagnózy třeba zohlednit meteorologická data regionu a roku. V případě vína a ovoce bylo prokázáno, že izotopové parametry ethanolu reagují i ​​na jemné změny prostředí a účinně charakterizují produkční oblast.[5][6]

Od roku 1991 je v EU vybudována izotopová databáze Společné výzkumné středisko Evropské komise (ES-SVS) týkající se vín všech evropských členů. Databáze obsahuje několik tisíc záznamů o evropských vínech [7] a je každý rok udržována a aktualizována. Tato databáze je přístupná všem oficiálním veřejným laboratořím. Soukromé společnosti zapojené do kontroly potravin a nápojů také shromáždily autentické vzorky a vytvořily konkrétní databáze.[8]

Srovnáním tedy specifické frakcionace přírodních izotopů odpovídající každému místu molekuly ethanolu vína s místem molekuly známé a odkazované v databázi. Lze zkontrolovat zeměpisný původ, botaniku a způsob výroby molekuly ethanolu, a tedy pravost vína.[9]

Aplikace na ocet a kyselinu octovou

Obrázek 11 - Žádost o ocet

Počátky octů získaných bakteriální nebo chemickou oxidací ethanolu vzniklých fermentací různých cukrů lze identifikovat podle 2H-SNIF-NMR. Umožňuje kontrolovat kvalitu octa a určit, zda pochází z cukrové třtiny, vína, sladu, jablečného moštu a alkoholu nebo z chemické syntézy.[10]

Žádost o vanilin

2H-SNIF-NMR je oficiální metoda AOAC pro stanovení přírodního vanilinu.

Hojnost pěti monodeuterovaných izotopomerů pro vanilin lze měřit pomocí 2H-SNIF-NMR. Molekula vanilinu je znázorněna na obrázku 11, všechna pozorovatelná místa, pro která lze měřit specifické koncentrace deuteria v daném místě, jsou označena číslem.

Pokud jde o víno nebo ovoce, interpretace výsledků z hlediska původu se provádí porovnáním izotopových parametrů analyzovaného vzorku s parametry ze skupiny referenčních molekul známého původu. Ukazuje se, že všechny původy vanilinu jsou dobře rozlišeny 2Data H-NMR. Zejména fazole vanilinu lze dobře odlišit od ostatních zdrojů, jak vidíme na obrázku 12 níže.

Navíc tato metoda jako jediná rozlišuje mezi přírodními a biosyntetickými zdroji vanilinu.[11]

Aplikace pro jiné aroma

Přirozenost různých aroma lze také zkontrolovat pomocí SNIF-NMR: například u anetholu lze množství pouze šesti monodeuterovaných izotopomerů měřit pomocí 2H-SNIF-NMR, která umožňuje rozlišení botanického původu fenyklu, badyánu nebo borovice.[12]

Další aplikace:SNIF-NMR použitá na benzaldehyd může detekovat falšování hořká mandle a skořice oleje. Je prokázáno, že obsah deuteria specifický pro danou lokalitu benzaldehyd umožnit určení původu molekuly: syntetické (např.toluen a ex-benzalchlorid ), přírodní (ex-jádra z meruňky, broskve, třešně a ex-hořká mandle) a polosyntetické (ex-cinnamaldehyd extrahované ze skořice).[13]Byly také zveřejněny další aplikace: malinový keton),[14] heliotropin,…

13C-SNIF-NMR

Obrázek 12 - Při této metodě jsou metabolity rostlin C3, C4 a CAM dobře odděleny

Jak je popsáno v práci E. Tenailleaua a S. Akoka, optimalizace parametrů techniky umožnila dosáhnout lepší přesnosti pro 13C NMR měření).[15]

The 13Metoda C-SNIF-NMR se nazývá metoda „nová hranice“, protože je to první analytická metoda, která dokáže odlišit cukry pocházející z rostlin metabolizujících C4 (třtina, kukuřice atd.) A některé crassulacean kyselé metabolické rostliny (CAM-metabolismus) jako ananas nebo agáve.[16]

Tuto metodu lze také použít na tequila produkty, kde dokáže odlišit autentickou 100% agáve tequilu, Misto tequila (vyrobené z nejméně 51% agáve) a výrobky vyrobené z většího podílu třtina nebo kukuřice cukru, a proto nedodržuje zákonnou definici tequily.[16]

Tato metoda bude v budoucnu určitě mít další aplikace v oblasti autenticity analýzy potravin a nápojů.

Reference

  1. ^ A b Eurofins Scientific - Celosvětové laboratorní testovací služby, „Eurofins Scientific - 1987 - 1997 - počáteční fáze“ (konzultováno 2. ledna 2014). http://www.eurofins.com/en/about-us/our-history/start-up-phase.aspx Archivováno 10.02.2015 na Wayback Machine
  2. ^ INPI: Institut National de la Propriété Industrielle, „Bases de Données Marques“ (konzultováno 6. ledna 2014). http://bases-marques.inpi.fr/
  3. ^ Nařízení Komise o Evropských společenstvích, 1990. (EHS) č. 000/90: „určování metod Společenství pro analýzu vína“. Brusel, Úřední věstník evropských společenství, s. 64-73
  4. ^ A b Oficiální metoda AOAC 995.17, Řepný cukr v ovocných šťávách, SNIF-NMR, AOAC International 1996
  5. ^ A b G. Martin, M.L. Martin. Moderní metody analýzy rostlin: „Metoda frakcionace přírodních izotopů podle NMR specifická pro studium vín“, vydání: HF Linskens a JF Jackson Springer Verlag, Berlin, 1988, s. 258-275
  6. ^ Martin GJ, Guillou C, Martin ML, Cabanis MT, Tep Y, Aerny J. J. Agric. Food Chem. 1988; 36: 316–22
  7. ^ Úřední věstník Evropských společenství. Vypnuto. J. Eur. Commun. 1991; L214: 39–43
  8. ^ Guillou C, Jamin E, Martin GJ, Reniero F, Wittkowski R, Wood R. Bulletin OIV. 2001; 74: 26–36
  9. ^ G. Martin, C. Guillou, Y.L. Martin, Přírodní faktory frakcionace izotopů a charakterizace vín “, Journal of Agricultural and Food Chemistry, č. 36, 1988, s. 1. 316-322
  10. ^ Místně specifická izotopová frakcionace vodíku při oxidaci ethanolu na kyselinu octovou. Aplikace na octy. (C. Vallet, M. Arendt, G. Martin), Biotechnology Techniques, sv. 2 č. 2, 1988
  11. ^ AOAC Official Method 2006.05, Site-specific Deuterium / Hydrogen (D / H) Ratios in Vanillin, AOAC International 2007
  12. ^ La Résonnance Magnétique Nucléaire du Deutérium en Abondance Naturelle, nová generace identifikačních údajů o původním výrobním programu potravin a aplikací pro průzkumné průzkumy Anétholes et des Estragoles. (G. Martin, M. Martin, F. Mabon, J. Bricout), Sciences des Aliments, 1983
  13. ^ G. Remaud, A. Debon, Y. Martin, G. Martin. Ověřování hořkého mandlového oleje a skořicového oleje: Aplikace metody SNIF-NMR na benzaldehyd, Journal of Agricultural and Food Chemistry, č. 45, 1997
  14. ^ Journal of High Resolution Chromatography, sv. 18, květen 1995,279-285
  15. ^ E. Tenailleau, S. Akoka. Adiabatické schéma rozpojení 1H pro velmi přesné měření intenzity ve 13C NMR, Journal of Magnetic Resonance, n ° 185, 2007, p50-58
  16. ^ A b F. Thomas, C. Randet, A. Gilbert, V. Silvestre, E. Jamin a kol. Vylepšená charakteristika rostlinného původu cukru metodou Carbon-13 SNIF-NMR Applied to Ethanol, Journal of Agricultural and Food Chemistry, č. 58, 2010, str. 11580-11585

Viz také