Úpravy epigenomu - Epigenome editing

Vizuální přehled toho, jak se proteiny TALE používají k úpravě epigenomu.

Úpravy epigenomu nebo Epigenomové inženýrství je druh genetického inženýrství, ve kterém epigenom je modifikován na specifických místech pomocí upravených molekul zaměřených na tato místa (na rozdíl od modifikací celého genomu). Zatímco úprava genů zahrnuje změnu samotné skutečné sekvence DNA, epigenetická úprava zahrnuje úpravu a prezentaci sekvencí DNA proteinům a dalším vazebným faktorům DNA, které ovlivňují funkci DNA. "Úpravou" epigenomických znaků tímto způsobem mohou vědci určit přesnou biologickou roli epigenetické modifikace na daném místě.

Inženýrské proteiny používané pro editaci epigenomu se skládají z DNA vazebné domény, která cílí na specifické sekvence, a z efektorové domény, která modifikuje epigenomické rysy. V současné době se k úpravě epigenomu převážně používají tři hlavní skupiny proteinů vázajících DNA: Zinkový prst bílkoviny, Efekty podobné transkripčním aktivátorům (TALE) a fúze Cas9 s nedostatkem nukleázy (CRISPR ).

Obecný koncept

Srovnání v celém genomu epigenetický mapy s genová exprese umožnil vědcům přiřadit aktivační nebo represivní role konkrétním změnám. Důležitost sekvence DNA při regulaci epigenomu byla prokázána použitím DNA motivů k předpovědi epigenomické modifikace.^[1] Další poznatky o mechanismech za sebou epigenetika pocházejí z in vitro biochemické a strukturní analýzy. Použitím modelové organismy, vědci dokázali popsat roli mnoha lidí chromatin faktory knokaut studie. Vyřazení celého modifikátoru chromatinu má však obrovské účinky na celý genom, což nemusí být přesná reprezentace jeho funkce v konkrétním kontextu. Jako jeden příklad toho Methylace DNA dochází v opakujte regiony, promotéři, zesilovače, a gen těla. Ačkoli Methylace DNA na genových promotorech typicky koreluje s genovou represí, methylace v tělech genů koreluje s aktivací genu a methylace DNA může také hrát roli při sestřihu genu.^[2] Schopnost přímo cílit a upravovat jednotlivá methylační místa je zásadní pro stanovení přesné funkce methylace DNA na konkrétním místě. Úpravy epigenomu je výkonný nástroj, který umožňuje tento typ analýzy. Pro webově specifické úpravy methylace DNA i pro úpravy histonů byly systémy pro úpravu genomu přizpůsobeny systémům pro úpravy epigenu. Stručně řečeno, proteiny navádějící genom s upravenými nebo přirozeně se vyskytujícími nukleázovými funkcemi pro editaci genů mohou být mutovány a adaptovány do čistě transportních systémů. Epigenetický modifikující enzym nebo doména může být fúzována s naváděcím proteinem a místní epigenetické modifikace mohou být pozměněny při náboru proteinu.

Cílení na proteiny

PŘÍBĚH

The Efekt podobný transkripčnímu aktivátoru (TALE) protein rozpoznává specifické sekvence DNA na základě jeho složení DNA vazebná doména.^[3] To umožňuje výzkumníkovi konstruovat různé proteiny TALE tak, aby rozpoznaly cílovou sekvenci DNA úpravou primární proteinové struktury TALE. Vazebná specificita tohoto proteinu je poté typicky potvrzena použitím Chromatinová imunoprecipitace (ChIP) a Sangerovo sekvenování výsledného fragmentu DNA.^[4][5][6] Toto potvrzení je stále vyžadováno u všech výzkumů rozpoznávání sekvencí TALE.^[7]Pokud se použijí k úpravě epigenomu, jsou tyto proteiny vázající DNA připojeny k efektorovému proteinu. Mezi efektorové proteiny, které byly použity pro tento účel, patří Deset jedenáct translokace methylcytosin dioxygenázy 1 (TET1),^[5] Lysin (K) specifická demetyláza 1A (LSD1)^[6] a Vápník a integrin vázající protein 1 (CIB1).^[4]

Proteiny se zinkovým prstem

Použití zinkový prst -fúzní proteiny rozpoznávající místa pro editaci epigenomu byly také prozkoumány. Maeder a kol. zkonstruoval protein ZF-TET1 pro použití při demethylaci DNA.^[5] Tyto proteiny se zinkovým prstem fungují podobně TALE proteiny v tom, že jsou schopni se vázat na sekvenčně specifická místa v DNA na základě jejich proteinové struktury, kterou lze modifikovat. Chen a kol. úspěšně použili doménu vázající DNA se zinkovým prstem spojenou s doménou TET1 protein k vyvolání demetylace několika dříve umlčených genů.^[8]

CRISPR-Cas

The Klastrované regulační mezery s krátkým palindromickým opakováním (CRISPR) -Cas systém funguje jako DNA specifická nukleáza.^[9] V dobře studovaném systému CRISPR typu II se nukleáza Cas9 asociuje s chimérou složenou z tracRNA a crRNA. Tato chiméra se často označuje jako vodicí RNA (gRNA). Když se protein Cas9 asociuje s gRNA specifickou pro oblast DNA, štěpí Cas9 DNA na cílová místa DNA. Když jsou však zavedeny bodové mutace D10A a H840A, je generován katalyticky mrtvý Cas9 (dCas9), který může vázat DNA, ale neštěpí se.^[10] Systém dCas9 byl použit pro cílené epigenetické přeprogramování za účelem zavedení methylace DNA specifické pro dané místo. Spojením DNMT3a katalytická doména s proteinem dCas9, je dCas9-DNMT3a schopen dosáhnout cílové methylace DNA cílové oblasti, jak je specifikováno v této vodicí RNA.^[11] Podobně byl dCas9 fúzován s katalytickým jádrem lidské acetyltransferázy p300. dCas9-p300 úspěšně katalyzuje cílenou acetylaci histonového H3 lysinu 27.^[12]

Varianta editace epigenomu CRISPR (zvaná FIRE-Cas9) umožňuje zvrátit provedené změny, pokud by se něco pokazilo.^[13][14]

Běžně používané efektorové proteiny

TET1 indukuje demetylaci cytosinu při CpG stránky. Tento protein byl použit k aktivaci genů, které jsou potlačovány methylací CpG a ke stanovení role jednotlivých methylačních míst CpG.^[5] LSD1 vyvolává demetylaci H3K4me1 / 2, což také způsobuje nepřímý účinek deacetylace na H3K27. Tento efektor lze použít na histony v oblastech zesilovače, které mohou změnit expresi sousedních genů.^[6] CIB1 je citlivý na světlo kryptochrom, je tento kryptochrom fúzován s proteinem TALE. Druhý protein obsahuje interakčního partnera (CRY2 ) fúzovaný s a chromatin / Modifikátor DNA (např. SID4X ). CRY2 je schopen komunikovat s CIB1 když byl kryptochrom aktivován osvětlením modrým světlem.^[15] Interakce umožňuje modifikátoru chromatinu působit na požadovaném místě. To znamená, že modifikace může být provedena indukovatelným a reverzibilním způsobem, což snižuje dlouhodobé sekundární účinky, které by byly způsobeny konstitutivní epigenetickou modifikací.^[4]

Aplikace

Studium funkce a aktivity zesilovače

Úpravy oblastí zesilovačů genů v genomu pomocí cílené epigenetické modifikace prokázaly Mendenhall et al. (2013).^[6] Tato studie využila efektorový fúzní protein TALE-LSD1 za účelem zacílení zesilovačů genů, k indukci umlčení zesilovače za účelem odvození aktivity zesilovače a kontroly genů. Cílení na konkrétní zesilovače následované specifickými lokusy RT-qPCR umožňuje určit geny ovlivněné umlčeným zesilovačem. Alternativně vyvolání umlčení zesilovače v oblastech před geny umožňuje změnu genové exprese. RT-qPCR potom lze použít ke studiu účinků tohoto na genovou expresi. To umožňuje podrobně studovat funkci a aktivitu zesilovače.^[6]

Stanovení funkce konkrétních methylačních míst

Je důležité porozumět roli, kterou specifické methylační místa hrají při regulaci genové exprese. Aby to bylo možné studovat, jedna výzkumná skupina použila fúzní protein TALE-TET1 k demetylaci jednoho methylačního místa CpG.^[5] Ačkoli tento přístup vyžaduje mnoho kontrol k zajištění specifické vazby na cílové lokusy, správně provedená studie využívající tento přístup může určit biologickou funkci konkrétního methylačního místa CpG.^[5]

Přímé určení role epigenetických modifikací

Epigenetická editace pomocí indukovatelného mechanismu nabízí širokou škálu potenciálního využití ke studiu epigenetických účinků v různých stavech. Jedna výzkumná skupina zaměstnávala optogenetický dvouhybridní systém, který integroval sekvenčně specifickou doménu vázající DNA na TALE s proteinem kryptochromu 2 citlivým na světlo (CIB1 ).^[4] Jakmile byl systém exprimován v buňkách, dokázal indukovatelně upravit modifikace histonu a určit jejich funkci v konkrétním kontextu.^[4]

Omezení

Specifičnost sekvence je při editaci epigenomu kriticky důležitá a musí být pečlivě ověřena (lze to provést pomocí imunoprecipitace chromatinu následován Sangerovo sekvenování ověřit cílenou sekvenci).^[7] Není známo, zda fúze TALE může způsobit účinky na katalytickou aktivitu modifikátoru epigenomu. To by mohlo být zvláště důležité u efektorových proteinů, které vyžadují více podjednotek a komplexů, jako je Polycomb represivní komplex.^[7] Proteiny používané k úpravě epigenomu mohou bránit ligandům a substrátům v cílovém místě.^[7] Samotný protein TALE může dokonce konkurovat transkripční faktory pokud jsou zaměřeny na stejnou sekvenci.^[7] Systémy pro opravu DNA by navíc mohly zvrátit změny na chromatinu a zabránit provedení požadovaných změn.^[7] Proto je nutné, aby fúzní konstrukty a mechanismy cílení byly optimalizovány pro spolehlivou a opakovatelnou editaci epigenomu.

Odkazy pro další čtení

• Srivastava, D .; DeWitt, N. (2016). „Přeprogramování buněk in vivo: nová generace“. Buňka. 166 (6): 1386–1396. doi:10.1016 / j.cell.2016.08.055. PMC  6234007. PMID  27610565.
• Chakraborty, S .; Ji, H .; Kabadi, A. M .; Gersbach, C. A .; Christoforou, N .; Leong, K. W. (2014). „Systém CRISPR / Cas9 pro přeprogramování specifikace buněčné linie“. Zprávy o kmenových buňkách. 3 (6): 940–947. doi:10.1016 / j.stemcr.2014.09.013. PMC  4264059. PMID  25448066.
• Thakore, P. I .; Black, J. B .; Hilton, I. B .; Gersbach, C. A. (2016). „Úpravy epigenomu: technologie pro programovatelnou transkripci a epigenetickou modulaci“. Přírodní metody. 13 (2): 127–137. doi:10,1038 / nmEth. 3733. PMC  4922638. PMID  26820547.
• Vora, S .; Tuttle, M .; Cheng, J .; Church, G. (2016). „Další zastávka v revoluci CRISPR: epigenetické regulátory naváděné RNA“. FEBS Journal. 283 (17): 3181–3193. doi:10.1111 / febs.13768. PMID  27248712.
• Nelson, C.E .; Gersbach, C. A. (2016). „Engineering Delivery Vehicles for Genome Editing“. Roční přehled chemického a biomolekulárního inženýrství. 7: 637–662. doi:10.1146 / annurev-chembioeng-080615-034711. PMID  27146557.
• Hilton, I. B .; D'Ippolito, A. M .; Vockley, C. M .; Thakore, P. I .; Crawford, G. E .; Reddy, T. E.; Gersbach, C. A. (2015). „Úpravy epigenomu acetyltransferázou na bázi CRISPR-Cas9 aktivují geny z promotorů a enhancerů“. Přírodní biotechnologie. 33 (5): 510–517. doi:10,1038 / nbt.3199. PMC  4430400. PMID  25849900.
• McDonald, J. I .; Celik, H .; Rois, L. E.; Fishberger, G .; Fowler, T .; Rees, R .; Challen, G. A. (2016). „Přeprogramovatelný systém CRISPR / Cas9 pro indukci methylace DNA specifické pro dané místo“. Biologie otevřená. 5 (6): 866–874. doi:10,1242 / bio.019067. PMC  4920199. PMID  27170255.
• Xu, X .; Tao, Y .; Gao, X .; Zhang, L .; Li, X .; Zou, W .; Hu, R. (2016). „Přístup CRISPR pro cílenou demethylaci DNA“. Objev buněk. 2: 16009. doi:10.1038 / celldisc.2016.9. PMC  4853773. PMID  27462456.
• Zalatan, J. G .; Lee, M.E .; Almeida, R .; Gilbert, L. A .; Whitehead, E. H .; La Russa, M .; Lim, W. A. ​​(2015). „Inženýrství složitých syntetických transkripčních programů s CRISPR RNA scaffolds“. Buňka. 160 (1): 339–350. doi:10.1016 / j.cell.2014.11.052. PMC  4297522. PMID  25533786.
• Morita, S .; Noguchi, H .; Horii, T .; Nakabayashi, K .; Kimura, M .; Okamura, K .; Hatada, I. (2016). „Cílená demethylace DNA in vivo pomocí dCas9-peptidové repetice a scFv-TET1 fúzí katalytické domény“. Přírodní biotechnologie. 34 (10): 1060–1065. doi:10.1038 / nbt.3658. PMID  27571369.
• Liu, X. S .; Wu, H .; Ji, X .; Stelzer, Y .; Wu, X .; Czauderna, S .; Jaenisch, R. (2016). „Úpravy methylace DNA v genomu savců“. Buňka. 167 (1): 233–247. doi:10.1016 / j.cell.2016.08.056. PMC  5062609. PMID  27662091.
• Amabile, A .; Migliara, A .; Capasso, P .; Biffi, M .; Cittaro, D .; Naldini, L .; Lombardo, A. (2016). „Dědičné umlčení endogenních genů cílenou epigenetickou editací typu„ hit-and-run ““. Buňka. 167 (1): 219–232. doi:10.1016 / j.cell.2016.09.006. PMC  5039111. PMID  27662090.
• Tompkins JD. www.epigenomeengineering.com
• Aktivace CRISPR jednotlivých genů mění kožní buňky na kmenové
• Liao, H. K .; Hatanaka, F .; Araoka, T .; Reddy, P .; Wu, M. Z .; Sui, Y .; Esteban, C.R .; Izpisua Belmonte, J.C. (2017). „Aktivace cílového genu in vivo prostřednictvím transepigenetické modulace zprostředkované CRISPR / Cas9“. Buňka. 171 (7): 1495–1507. doi:10.1016 / j.cell.2017.10.025. PMC  5732045. PMID  29224783.
• Lau, C.H .; Suh, Y. (2018). „Úpravy epigenomu in vivo a transkripční modulace pomocí technologie CRISPR“. Transgenní výzkum. 27 (6): 489–509. doi:10.1007 / s11248-018-0096-8. PMC  6261694. PMID  30284145.

Reference