Cytotoxicita závislá na komplementu - Complement-dependent cytotoxicity

Cytotoxicita závislá na komplementu (CDC) je efektorová funkce IgG a IgM protilátky. Když jsou vázáni na povrch antigen na cílové buňce (např. bakteriální nebo virové infikované buňky), klasická cesta komplementu se spouští lepením protein C1q na tyto protilátky, což vede k tvorbě a komplexní membránový útok (MAC) a lýza cílových buněk.

Systém komplementu je účinně aktivován lidskými protilátkami IgG1, IgG3 a IgM, slabě protilátkami IgG2 a není aktivován protilátkami IgG4.[1]

Je to jeden mechanismus působení, kterým terapeutické protilátky[2] nebo fragmenty protilátek[3] může dosáhnout protinádorového účinku.[4][5]

Použití testů CDC

Terapeutické protilátky

Vývoj protinádorových terapeutických protilátek zahrnuje in vitro analýza jejich efektorových funkcí včetně schopnosti spouštět CDC zabíjet cílové buňky. Klasickým přístupem je inkubace protilátek s cílovými buňkami a zdrojem komplementu (sérum ). Poté je buněčná smrt určena několika přístupy:

  • Radioaktivní metoda: cílové buňky jsou označeny 51Cr před testem CDC se během lýzy buněk uvolňuje chrom a množství radioaktivita se měří.[6][7]
  • Měření metabolické aktivity živých buněk (barvení živých buněk): po inkubaci cílových buněk s protilátkami a komplementem, plazmatická membrána - přidá se propustné barvivo (např. kalcein -DOPOLEDNE[7][8] nebo resazurin[6][9]). Živé buňky jej metabolizují na nepropustný fluorescenční produkt, který lze detekovat pomocí průtoková cytometrie. Tento produkt nelze tvořit v metabolicky neaktivních mrtvých buňkách.
  • Měření aktivity uvolněných intracelulárních enzymů: uvolnění mrtvých buněk enzym (např. LDH nebo GAPDH )[6] a jeho přidání Podklad vede ke změně barvy, která se obvykle kvantifikuje jako změna absorbance nebo luminiscence.
  • Barvení odumřelých buněk: (fluorescenční) barvivo se dostane dovnitř odumřelých buněk přes jejich poškozenou plazmatickou membránu. Například propidium jodid váže na DNA mrtvých buněk a fluorescenční signál se měří průtokovou cytometrií.[6]

HLA psaní a křížový test

Testy CDC se používají k nalezení vhodného dárce pro orgán nebo kostní dřeň transplantace, a to dárce s párováním fenotyp z systém histokompatibility HLA.[10] Nejprve se typizace HLA provádí u pacientů a dárců, aby se určily jejich fenotypy HLA. Pokud je nalezen potenciálně vhodný pár, provede se křížový test, aby se vyloučilo, že pacient produkuje anti-HLA protilátky specifické pro dárce, což by mohlo způsobit odmítnutí štěpu.

CDC forma HLA typizace (jinými slovy sérologická typizace) používá šarži anti-HLA protilátek od charakterizovaných allogenní antiséra nebo monoklonální protilátky. Tyto protilátky jsou inkubovány jeden po druhém s pacientem nebo dárcem lymfocyty a zdroj doplňku. Množství odumřelých buněk (a tedy pozitivní výsledek) se měří barvením odumřelých nebo živých buněk. V dnešní době je typizace CDC nahrazována molekulární typizací, která umožňuje identifikaci nukleotid sekvence molekul HLA prostřednictvím PCR.[10]

Pro provedení křížového testu se obvykle používá test CDC. Základní verze zahrnuje inkubaci séra pacienta s dárcovskými lymfocyty a druhou inkubaci po přidání králičího doplňku. Přítomnost mrtvé buňky (pozitivní test) znamená, že dárce není pro tohoto konkrétního pacienta vhodný. K dispozici jsou úpravy ke zvýšení citlivosti testu, včetně prodloužení minimální doby inkubace a přidání antihumánní globulin (AHG), odstranění nenavázaných protilátek před přidáním komplementu, separace T buňka a B buňka podmnožina. Kromě křížového porovnávání CDC je k dispozici křížové porovnávání s průtokovou cytometrií, které je citlivější a dokáže detekovat i komplement neaktivní protilátky.[11]

Viz také

Reference

  1. ^ Schroeder, Harry W .; Cavacini, Lisa (2010). "Struktura a funkce imunoglobulinů". Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2010 Primer pro alergické a imunologické nemoci. 125 (2, dodatek 2): S41 – S52. doi:10.1016 / j.jaci.2009.09.046. ISSN  0091-6749. PMC  3670108. PMID  20176268.
  2. ^ Role komplementu v mechanismu působení rituximabu na lymfom B-buněk: důsledky pro terapii. Zhou 2008
  3. ^ Aktivita cytotoxicity závislá na komplementu terapeutických fragmentů protilátek je získána imunogenní glykanovou vazbou. Archivováno 2016-04-09 na Wayback Machine
  4. ^ Meyer, Saskia; Leusen, Jeanette HW; Boross, Peter (2014). „Regulace komplementu a modulace jeho aktivity při léčbě rakoviny monoklonálními protilátkami“. mAb. 6 (5): 1133–1144. doi:10,4161 / mabs.29670. ISSN  1942-0862. PMC  4622586. PMID  25517299.
  5. ^ Wang, Xinhua; Mathieu, Mary; Brezski, Randall J. (2018). "IgG Fc inženýrství k modulaci funkcí efektoru protilátky". Protein & Cell. 9 (1): 63–73. doi:10.1007 / s13238-017-0473-8. ISSN  1674-800X. PMC  5777978. PMID  28986820.
  6. ^ A b C d Taylor, Ronald P .; Lindorfer, Margaret A. (2014). „Role komplementu v terapii rakoviny založené na mAb“. Metody. 65 (1): 18–27. doi:10.1016 / j.ymeth.2013.07.027. ISSN  1095-9130. PMID  23886909.
  7. ^ A b Hernandez, Axel; Parmentier, Julie; Wang, Youzhen; Cheng, Jane; Bornstein, Gadi Gazit (2012). "Charakterizace olova monoklonální protilátky: metody in vitro a in vivo". Protilátkové inženýrství. Metody v molekulární biologii. 907. str. 557–594. doi:10.1007/978-1-61779-974-7_32. ISBN  978-1-61779-973-0. ISSN  1940-6029. PMID  22907374.
  8. ^ Gillissen, M. A.; Yasuda, E .; de Jong, G .; Levie, S.E .; Bůh.; Spits, H .; van Helden, P.M .; Hazenberg, M.D. (2016). „Upravený test retence FACS kalceinu AM: Metoda měření průtokové cytometrie s vysokou propustností pro měření cytotoxicity“. Journal of Immunological Methods. 434: 16–23. doi:10.1016 / j.jim.2016.04.002. PMID  27084117.
  9. ^ Gazzano-Santoro, Hélène; Ralph, Peter; Ryskamp, ​​Thomas C; Chen, Anthony B; Mukku, Venkat R (1997). "Neradioaktivní test na cytotoxicitě závislý na komplementu pro anti-CD20 monoklonální protilátku". Journal of Immunological Methods. 202 (2): 163–171. doi:10.1016 / S0022-1759 (97) 00002-1. PMID  9107305.
  10. ^ A b Gautreaux, Michael D. (2017), Orlando, Giuseppe; Remuzzi, Giuseppe; Williams, David F. (eds.), „Kapitola 17 - Histocompatibility Testing in the Transplant Setting“, Transplantace ledvin, bioinženýrství a regenerace, Akademický tisk: 223–234, doi:10.1016 / B978-0-12-801734-0.00017-5, ISBN  9780128017340, vyvoláno 2019-08-30
  11. ^ Guillaume, Nicolas (2018). "Vylepšené porovnávání průtokové cytometrie při transplantaci ledvin". HLA. 92 (6): 375–383. doi:10,1111 / tan.13403. ISSN  2059-2310. PMID  30270577.