Chiméra se zinkovým prstem - Zinc finger chimera

Proteinová chiméra se zinkovým prstem jsou chimérické proteiny složený z vazby DNA protein zinkového prstu doména a další doména, jejímž prostřednictvím protein uplatňuje svůj účinek. Efektorovou doménou může být a transkripční aktivátor (A) nebo represor (R),[1] methylační doména (M) nebo a nukleáza (N).[2]

Modifikace endogenní DNA vázající domény zinkového prstu je základem nejpokročilejšího pole v konstrukci genově specifické umělé transkripční faktory.[1] Propojení šesti ZFP produkuje cílové místo 18-19 bp. Za předpokladu specificity k jedné sekvenci a že sekvence genomu je náhodná, je 18 bp dostatečně dlouhá, aby byla jedinečná ve všech známých genomech[3][4] Ve skutečnosti se mezery mezi podřízenými stránkami stávají součástí cílové sekvence kvůli omezením flexibility proteinu, který lze ovládat.[1] Cílení na stránky o velikosti pouhých 9 bazických bodů poskytuje určitý stupeň specificity, téměř jistě lze přičíst v některých částech okluzi chromatinu.[4]

Produkce proteinové domény se zinkovým prstem

V závislosti na požadavcích vyšetřování je k dispozici několik technik k definování domény rozpoznávání DNA, která propůjčí specificitu transkripčního faktoru založeného na ZFP. Tři fágový displej byly popsány strategie zahrnující buď paralelní, sekvenční nebo bipartitní výběr složek zinkových prstů.

Paralelní výběr

Přístup paralelního výběru (obr. 1 (A)) předpokládá, že jednotlivé domény zinkového prstu jsou funkčně nezávislé. Na tomto základě by existující předem určené domény měly být použitelné bez dalšího designu nebo výběru, což z něj činí rychlou a dostupnou techniku ​​pro jakoukoli laboratoř.[5][6] To není pravda v každém případě, takže tato strategie může trpět souvisejícími problémy překrytí cílového webu na řadě cílových sekvencí, jak bude diskutováno později. Je-li to nutné, je možné překonat problém překrývání cílového místa randomizací aminokyselinových zbytků na rozhraní dvou zinkových prstů, ve kterých k nim dochází.[5]

Sekvenční výběr

Sekvenční selekce (obr. 1 (B)), kterou předložila skupina Pabo v roce 1997, zahrnuje kooperativní vazbu mezi zinkovými prsty, aby se vytvořily domény vázající DNA s velkou afinitou a specificitou.[7] Jak naznačuje název, každý prst je vybrán z randomizované knihovny v kontextu dříve vybraného prstu. Techniky použité při výběru jsou podobné těm popsaným níže, kromě toho, že cílový oligonukleotid použitý při výběru obsahuje celou cílovou sekvenci. Jak je znázorněno na obr. 1, je vytvořena knihovna, ve které prst tři obsahuje randomizovanou alfa-šroubovici. Je vybrána doména s nejlepšími charakteristikami vazby a poté zahrnuta do jiné knihovny, ve které je odstraněna kotva prvního prstu a na druhý konec je přidán další náhodný prst. To pokračuje a vede k doméně vázající DNA, ve které byly všechny prsty vybrány v kontextu sousedního prstu, a protože každé kolo výběru je aplikováno na stejnou konečnou cílovou sekvenci, stále dochází k překrytí cílového místa, ale je to spíše přínos než překážka.

Hlavní nevýhodou tohoto přístupu je nutnost vytvořit pro každý zinkový prst samostatnou knihovnu, která přesahuje kapacitu většiny laboratoří.

Bipartitní výběr

Metodu bipartitního výběru (obr. 1 (C)) navrhl Isalan et al., 2001[8] jako kompromis mezi strategiemi paralelního a sekvenčního výběru. První a poslední 5 bp z 9 bp cílového místa jsou vybrány paralelně a spojeny za vzniku knihovny, ze které je vybrán konečný ZFP.

Aby se velikost knihovny udržovala v rozumných mezích, je tato technika omezena na randomizaci pouze klíčových zbytků zapojených do rozpoznávání báze. Kromě toho, na rozdíl od paralelního výběru, vyžaduje tato technika vícenásobné posouvání, než bude možné zkonstruovat nový ZFP.[6]

Výběr zinkového prstu pomocí fágového displeje

Pro stanovení nejvhodnější sekvence aminokyselin v alfa-šroubovici zinkového prstu pro vazbu k dané sekvenci DNA může být použita technika zahrnující fágový displej. Změnou genomu vybraného bakteriofága je možné vytvořit fág, který bude zobrazovat ZFP jako součást svého proteinového obalu. Takový fág může být následně testován na adherenci prostřednictvím připojených zinkových prstů k oligonukleotidu obsahujícímu sledovanou sekvenci, zatímco jiné, nepřilnavé fágy jsou odplaveny. DNA ve fágových kódech pro ZFP exprimovaná, takže extrakce a sekvenování DNA navázaného fága poskytuje informace o vhodných konfiguracích aminokyselin pro vazbu specifické sekvence. To tvoří základ vyšetřování vazby ZFP pomocí fágového displeje.[9][10]

Práce se obvykle provádí pomocí myšího ZFP-TF Zif268 nebo jeden z jeho derivátů, jako základ modifikace sekvence zinkovým prstem, protože je nejlépe charakterizován ze všech proteinů se zinkovým prstem.[3][10] Jeho deriváty C7 nebo C7. GAT, se často používají pro svou vynikající vazebnou afinitu a specificitu. C7.GAT byl použit ke zkoumání rodin sekvencí 5'-ANN-3 'a 5'-CNN-3', protože třetí prst C7 definuje guanin nebo thymin v poloze 5 'sekvence prstu dva (cíl překrývání stránek).[4][10][11] Vláknité pomocný fág a DNA z fága lambda jsou použity ve fágovém displeji. Kvůli omezením velikosti knihoven, která lze rutinně konstruovat, může být randomizace omezena na nejvlivnější aminokyseliny v sekvenci ZFP, jak je odvozeno Rentgenová krystalografie. Pozice byly identifikovány jako polohy šroubovice -1, 2, 3, 4, 5 a 6 v prstech jedna a tři a pozice -2, -1, 1, 2, 3 a 4 v prstu dva ve studii publikované Wu et al. (1995),[10] nicméně další studie Segala a kol. (1999)[3] naznačuje důležitost všech pozic od -2 do 6 kvůli nespecifické afinitě některých aminokyselin a schopnosti jiných stabilizovat sousední interakce.

In vitro výběr zinkových prstů

Jako cíl je použita krátká (~ 34 nt) vlásenka DNA obsahující vazebné místo ZFP se změnami vyskytujícími se v jednom podřízeném místě. The oligonukleotid použitý může být syntetizován tak, aby zahrnoval primární n-hexyl aminoskupinu na jejím 5 'konci, později použit k připojení hovězí sérový albumin (BSA). V tomto případě se konjugát použije k předběžnému potažení mikrotitrační jamky před aplikací ~ 1013 kolonie tvořící jednotky fága. Po inkubaci se fág odstraní a destička se promyje pufrem obsahujícím 0,5% Tween 20 k odstranění nepřilnavého fága.[10] Použitím kyselého elučního pufru se adherentní fág odstraní a neutralizuje se Tris základna.[9] Dokončují se další kola rýžování, aby se zajistilo obohacení vzorku, infikováním bakteriálních buněk eluovaným fágem a pomocným fágem a potom shromážděním [ZFP-zobrazujícího] fága vytvořeného pro další kolo rýžování. Alternativou k BSA může být cílová DNA vlásenky biotinylovaný a později extrahován pomocí streptavidin potažené magnetické kuličky (streptavidin vytváří velmi silné vazby s biotinem).[3]

Pro zvýšení specificity vybraného fága, zejména tam, kde se zkoumají větší knihovny, se používají konkurenční oligonukleotidy k sekvestraci těch proteinů se zinkovým prstem s nižší specificitou před přidáním biotinylovaného cílového oligonukleotidu. Například stříhaná DNA spermatu sledě bude vázat fág s nespecifickou adherencí k DNA. Následná kola rýžování zahrnují zvyšování koncentrací specificky syntetizovaných necílových oligonukleotidů, kde všechny kromě sekvence cílového podřízeného místa zůstávají stejné, až do jediného rozdílu nukleotidů. Konkrétně se cílová sekvence původního ZFP, která byla podrobena mutagenezi, používá ve velkém množství k selekci proti „rodičovskému fágu“ kontaminujícímu knihovnu. Vazba streptavidinem potažených magnetických kuliček může být blokována blotovým a protilátkovým zobrazovacím (irelevantním) fágem, takže k vazbě dochází pouze k molekulám s tak vysokou afinitou, jako je biotin. Nespecifický fág se odstraní jako dříve za použití pufru včetně zředěného Tween 20. Navázaný fág se shromáždí pomocí magnetických kuliček a lze je eluovat inkubací s trypsin. Budou tedy vybráni pouze ti fágové, kteří zobrazují vysoce specifické ZFP.[3][11]

Po eluci může být fág nanesen na plátky a DNA extrahována z jednotlivých jednotek tvořících plaky, omezena a fragmenty odpovídající velikosti extrahovány po separaci pomocí PAGE. DNA pak může být sekvenována, aby se objevila primární struktura proteinu, která produkuje adherenci k cílové sekvenci. Tento proces se opakuje pro každý z 5'-NNN-3 'podřízených webů s jedním prstem, který je zkoumán.

Upravená zinková pole prstů

Generování polí vytvořených Cys2Jeho2 zinkové prsty je nejrozvinutější metoda pro tvorbu proteinů schopných zacílit na požadované sekvence genomové DNA. Většina vytvořených polí se zinkovým prstem je založena na doméně se zinkovým prstem myšího transkripčního faktoru Zif268, ačkoli některé skupiny používaly pole se zinkovým prstem založené na lidském transkripčním faktoru SP1. Zif268 má tři individuální motivy zinkových prstů, které společně váží sekvenci 9 bp s vysokou afinitou.[12]Struktura tohoto proteinu vázaného na DNA byla vyřešena v roce 1991[13] a stimuloval velké množství výzkumu v oblasti zinkových prstových polí. V letech 1994 a 1995 byla použita řada skupin fágový displej ke změně specificity jediného zinkového prstu Zif268.[14][15][16][17]Carlos F. Barbas a kol. rovněž uvedl v patentové literatuře vývoj technologie zinkového prstu a byla jim udělena řada patentů, které byly důležité pro komerční vývoj technologie zinkových prstů.[18][19] Typická maticová pole zinkových prstů mají mezi 3 a 6 individuálními motivy zinkových prstů a váží cílová místa v délce od 9 párů do 18 párů. Pole s motivy 6 zinkových prstů jsou obzvláště atraktivní, protože vážou cílové místo, které je dostatečně dlouhé, aby mělo dobrou šanci být jedinečným v genomu savce.[20]Existují dvě hlavní metody, které se v současné době používají ke generování zinkových prstových polí, modulární sestavy a systému pro výběr bakterií, a diskutuje se o tom, která metoda je nejvhodnější pro většinu aplikací.[21][22]

Modulární montáž

Nejpřímější metodou pro generování nových polí se zinkovým prstem je kombinace menších „modulů“ se zinkovým prstem se známou specifičností. Struktura proteinu Zif268 se zinkovým prstem navázaného na DNA popsaná Pavletichem a Pabo v jejich publikaci z roku 1991 byla klíčem k velké části této práce a popisuje koncept získání prstů pro každý ze 64 možných tripletů bázových párů a jejich smíchání prsty navrhnout proteiny s jakoukoli požadovanou sekvenční specificitou.[13] Nejběžnější postup modulárního sestavení zahrnuje kombinování samostatných zinkových prstů, které každý dokáže rozpoznat sekvenci DNA o 3 párech bází a generovat pole se 3 prsty, 4, 5 nebo 6 prsty, které rozpoznají cílová místa v délce od 9 párů do 18 párů . Další metoda používá 2-prstové moduly ke generování polí zinkových prstů až se šesti samostatnými zinkovými prsty.[23] Byla použita Barbasova laboratoř Výzkumného ústavu Scripps fágový displej vyvinout a charakterizovat domény zinkového prstu, které rozpoznávají většinu tripletových sekvencí DNA[24][25][26]zatímco jiná skupina izolovala a charakterizovala jednotlivé prsty z lidského genomu.[27]Potenciální nevýhodou modulárního sestavení je obecně to, že specifičnosti jednotlivých zinkových prstů se mohou překrývat a mohou záviset na kontextu okolních zinkových prstů a DNA. Nedávná studie prokázala, že vysoký podíl 3-prstových zinkových prstových polí generovaných modulárním sestavením nedokáže vázat svůj zamýšlený cíl s dostatečnou afinitou v bakteriálním dvouhybridním testu a nefunguje jako nukleázy zinkového prstu, ale míra úspěšnosti byla o něco vyšší, když byly cíleny stránky ve formě GNNGNNGNN.[28] Následující studie použila ke generování modulární sestavu nukleázy zinkového prstu u polí se třemi prsty a se čtyřmi prsty a u polí se čtyřmi prsty byla pozorována mnohem vyšší úspěšnost.[29] Rovněž byla popsána varianta modulární sestavy, která bere v úvahu kontext sousedních prstů, a tato metoda má tendenci poskytovat proteiny se zlepšeným výkonem ve srovnání se standardní modulární sestavou.[30]

Metody výběru

Pro generování zinkových prstových polí schopných cílit na požadované sekvence byla použita řada selekčních metod. Využito počáteční úsilí při výběru fágový displej k výběru proteinů, které váží daný cíl DNA z velké skupiny částečně randomizovaných polí se zinkovým prstem. Tuto techniku ​​lze obtížně použít na více než jednom zinkovém prstu najednou, proto byl vyvinut vícekrokový proces, který generoval zcela optimalizované pole 3 prstů přidáním a optimalizací jediného zinkového prstu najednou.[31]Novější snahy využívají kvasinkové jednohybridní systémy, bakteriální jednohybridní a dvouhybridní systémy a savčí buňky. Slibná nová metoda výběru nových 3-prstových zinkových prstových polí využívá bakteriální dvouhybridní systém a jeho tvůrci jej nazvali „OTEVŘENO“.[32] Tento systém kombinuje předem vybrané pooly jednotlivých zinkových prstů, z nichž každý byl vybrán k navázání na daný triplet, a poté využívá druhé kolo selekce k získání polí 3 prstů schopných vázat požadovanou sekvenci 9 bp. Tento systém byl vyvinut konsorciem Zinc Finger Consortium jako alternativa ke komerčním zdrojům vytvořených zinkových prstových polí. Je poněkud obtížné přímo porovnat vazebné vlastnosti proteinů generovaných touto metodou s proteiny generovanými modulárním sestavením, protože profily specificity proteinů generovaných metodou OPEN nebyly nikdy hlášeny.

Aplikace

Vytvořená pole zinkových prstů lze poté použít v mnoha aplikacích, jako jsou umělé transkripční faktory, methylázy zinkových prstů, rekombinázy zinkových prstů a Nukleázy se zinkovým prstem.[33]Zatímco počáteční studie s jiným Doména vázající DNA z bakteriálních TAL efektory ukázat slib,[34][35][36][37] zbývá zjistit, zda jsou tyto domény vhodné pro některé nebo všechny aplikace, kde se v současné době používají upravené zinkové prsty. Umělé transkripční faktory s upravenými poli zinkových prstů byly použity v mnoha vědeckých studiích a umělý transkripční faktor, který aktivuje expresi VEGF je v současné době hodnocena u lidí jako potenciální léčba několika klinických indikací. Nukleázy se zinkovým prstem se staly užitečnými činidly pro manipulaci s genomy mnoha vyšších organismů včetně Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, tabák, kukuřice,[23] zebrafish,[38] různé druhy savčích buněk,[39] a krysy.[40] Probíhá hodnocení probíhající klinické studie Nukleázy se zinkovým prstem které narušují gen CCR5 v lidských T-buňkách CD4 + jako potenciální léčbu HIV / AIDS.[41]

Zkoumání závazných charakteristik

Tato zkoumání vyžadují použití rozpustných ZFP, protože připojení k fágu může změnit vazebné vlastnosti zinkových prstů.[3] Jakmile je vybrán ZFP, je jeho sekvence subklonovaný z pComb3H do modifikovaného bakteriálního expresního vektoru, pMal-c2, spojující jej se sekvencí kódující protein vázající maltózu. Rekombinantní látka se poté transformuje na XL1-modrá buňky a exprese je indukována přidáním isopropyl-p-D-thiogalaktosidu (IPTG). Zmrazené / rozmrazené extrakty mohou být poté čištěny pro použití v následujících experimentech. I když čištění není pro multitarget ELISA nutné, je nezbytné pro měření vazebné afinity pomocí plazmonové rezonance a stop DNázy. To lze provést pomocí a Sloupec FPLC s heparin-sefarózou ekvilibrováno zinkovým pufrem s následným potvrzením homogenity pomocí SDS PAGE gelová denzitometrie[4] Stejné techniky se používají ke zkoumání vazebných vlastností dokončené polydaktylové ZFP chiméry[42]

Testování specificity

Specifičnost ZFP vybraných fágovým displejem je testována pomocí multitargetu enzymová imunoanalýza (ELISA). ZFP se aplikují na mikrotitrační jamky potažené streptavidinem a biotinylovaným cílovým oligonukleotidem. Po inkubaci se jamky promyjí, aby se odstranily zinkové prsty, pokud nejsou adherentní k cílové sekvenci, následuje aplikace myší anti-MBP (protein vázající maltózu ) protilátka a inkubace. Kozí anti-myší protilátka spojená s alkalická fosfatáza Přidá se a nechá se vázat, následuje promytí, aby se odstranila protilátka, pokud není navázána na zinkové prsty. Přidá se substrát alkalické fosfatázy a po zastavení reakce se optická hustota při 405 nm (OD405) se stanoví pomocí spektrofotometrie[4]

Odečet ze spektrofotometru závisí na množství alkalické fosfatázy přítomné v jamce, které je zase úměrné vazbě dotyčného ZFP. Pokud se ZFP váže na sekvenci, pro kterou nebyl vybrán s příliš velkou afinitou, není pro většinu lékařských účelů dostatečně specifický a bude s největší pravděpodobností odmítnut.

Tyto testy se opakují s použitím různých cílových oligonukleotidů. Při zkoumání například zinkových prstů vázajících sekvence 5'-XNN-3 'bude třeba zkoumat všech 16 možných oligonukleotidových sekvencí. Dále, za účelem testování specificity k 5 'nukleotidu, úplného komplementu čtyř 5'-ANN-3', 5'-CNN-3 ', 5'-GNN-3'. Rodiny 5'-TNN-3 'se používají jako cíle ve čtyřech samostatných reakcích a relativní vazba v každé z nich se porovnává[4]

Kinetická analýza

Kinetická analýza poskytuje informace týkající se jak afinity, tak specifičnosti adheze zinkových prstů k cíli. To lze provést pomocí komerčně dostupného zařízení s využitím povrchová plazmonová rezonance. Povrch senzorového čipu je potažen afinitně čištěným streptavidinem před aplikací biotinylovaných oligonukleotidů, které také přilnou k povrchu.[10] Míra asociace (kna) se vypočítá měřením rychlosti vazby ZFP na povrch pomocí několika různých koncentrací proteinu, zatímco rychlost disociace (kvypnuto) lze vypočítat zvýšením rychlosti toku po asociaci. Matematika se provádí pomocí softwaru dodávaného s přístrojem.[10]

Alternativně Kd lze vypočítat z a test posunu gelové mobility ve kterém je stejný purifikovaný protein inkubován se sériovými ředěními gelově purifikovaného cílového oligonukleotidu značeného 32P-koncem. Inkubační reakce jsou poté vyřešeny po krátkou dobu na a polyakrylamidový gel a kvantifikovány pomocí komerčně dostupného zobrazovacího zařízení a softwaru. K.d se počítá přes Scatchardova analýza pomocí rovnice vazebné izotermy; θb = [peptid] / ([peptid] + K.d).[3][43]

Analýza stopy DNase I.

Hlavní článek: Analýza stopy DNase I.

Aby se určil prostor obsazený ZFP, když je navázán na svůj DNA cíl, fragment cílového genu je amplifikován pomocí PCR a smíchán s promotorovým fragmentem značeným 32P-koncem. Tato reakce se poté inkubuje s několika různými koncentracemi ZFP produkovaného a purifikovaného pomocí jedné z dříve popsaných nadměrných expresí (např. PMal-c2 a XL1-Blue) a purifikačních metod. Trávení s DNase I bude produkovat fragmenty různých délek, ale tam, kde se ZFP nechá vázat při vysoké koncentraci, nebudou ve směsi přítomny odpovídající délky fragmentů, protože aktivita DNázy byla na těchto místech ZFP uzavřena. Vzorky se oddělí na akrylamidovém (~ 6%), močovinovém (8 M) gelu, použijí se k vystavení fosforimagingových desek a zaznamená se komerčně dostupným fosforimagingovým zařízením. K výrobě K lze také použít softwarovou analýzud hodnoty[4]

Překrývání cílového webu

Hlavní článek: Překrývání cílového webu

Určité sekvence aminokyselinových zbytků jsou schopny rozpoznat a jsou specifické pro rozšířené cílové místo čtyř nebo dokonce pěti nukleotidů[44] Když k tomu dojde v ZFP, ve kterém jsou tři nukleotidové podřízené oblasti sousedící, jeden zinkový prst zasahuje do cílového místa zinkového prstu sousedícího s ním, což je situace známá jako překrytí cílového místa.

Faktory transkripce proteinů se zinkovým prstem

Hlavní článek: Faktor transkripce proteinu se zinkovým prstem

ZFP-TF, skládající se z aktivátorů a represorů, jsou transkripční faktory složený z proteinové domény se zinkovým prstem a jakékoli z řady efektorových domén transkripčního faktoru, které vyvíjejí svůj modulační účinek kolem jakékoli sekvence, na kterou se doména ZFP váže.

Nukleázy se zinkovým prstem

Hlavní článek: Nukleáza se zinkovým prstem

Nukleázy se zinkovým prstem zahrnují nukleázovou doménu, jako je FokI, schopné zavést dvouvláknové zlomy v místě jakékoli sekvence, na kterou se váže proteinová doména se zinkovým prstem.

Viz také

Reference

  1. ^ A b C Gommans WM, Haisma HJ, Rots MG (2005). „Inženýrské transkripční faktory proteinů se zinkovým prstem: terapeutický význam zapnutí nebo vypnutí endogenní genové exprese na povel“ (PDF). J. Mol. Biol. 354 (3): 507–19. doi:10.1016 / j.jmb.2005.06.082. PMID  16253273.
  2. ^ Durai S, Mani M, Kandavelou K, Wu J, Porteus MH, Chandrasegaran S (2005). „Nukleázy se zinkovým prstem: zakázkové molekulární nůžky pro genomové inženýrství rostlinných a savčích buněk“. Nucleic Acids Res. 33 (18): 5978–90. doi:10.1093 / nar / gki912. PMC  1270952. PMID  16251401.
  3. ^ A b C d E F G Segal DJ, Dreier B, Beerli RR, Barbas CF (1999). „Směrem k libovolné kontrole genové exprese: výběr a design domén se zinkovým prstem rozpoznávajících každou z cílových sekvencí DNA 5'-GNN-3 '“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (6): 2758–63. Bibcode:1999PNAS ... 96.2758S. doi:10.1073 / pnas.96.6.2758. PMC  15842. PMID  10077584.
  4. ^ A b C d E F G Dreier B, Fuller RP, Segal DJ a kol. (2005). „Vývoj domén se zinkovým prstem pro rozpoznávání sekvencí DNA rodiny 5'-CNN-3 'a jejich použití při konstrukci umělých transkripčních faktorů“. J. Biol. Chem. 280 (42): 35588–97. doi:10,1074 / jbc.M506654200. PMID  16107335.
  5. ^ A b Beerli RR, Barbas CF (2002). "Inženýrské transkripční faktory polydaktylu a zinku". Nat. Biotechnol. 20 (2): 135–41. doi:10.1038 / nbt0202-135. PMID  11821858.
  6. ^ A b Uil TG, Haisma HJ, Rots MG (2003). „Terapeutická modulace funkce endogenního genu látkami s navrženými specificitami sekvence DNA“. Nucleic Acids Res. 31 (21): 6064–78. doi:10.1093 / nar / gkg 815. PMC  275457. PMID  14576293.
  7. ^ Reynolds L, Ullman C, Moore M a kol. (2003). „Represe promotoru LTR HIV-1 5 'a inhibice replikace HIV-1 pomocí vytvořených transkripčních faktorů se zinkovým prstem“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (4): 1615–20. Bibcode:2003PNAS..100.1615R. doi:10.1073 / pnas.252770699. PMC  149881. PMID  12574502.
  8. ^ Isalan M, Klug A, Choo Y (2001). „Rychlá, obecně použitelná metoda výroby zinkových prstů ilustrovaná zaměřením na promotor HIV-1“. Nat. Biotechnol. 19 (7): 656–60. doi:10.1038/90264. PMC  2677679. PMID  11433278.
  9. ^ A b Barbas CF, Kang AS, Lerner RA, Benkovic SJ (1991). „Sestavování kombinačních knihoven protilátek na fágových površích: místo genu III“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (18): 7978–82. Bibcode:1991PNAS ... 88.7978B. doi:10.1073 / pnas.88.18.7978. PMC  52428. PMID  1896445.
  10. ^ A b C d E F G Wu H, Yang WP, Barbas CF (1995). „Budování zinkových prstů výběrem: směrem k terapeutické aplikaci“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (2): 344–8. Bibcode:1995PNAS ... 92..344W. doi:10.1073 / pnas.92.2.344. PMC  42736. PMID  7831288.
  11. ^ A b Dreier B, Beerli RR, Segal DJ, Flippin JD, Barbas CF (2001). „Vývoj domén se zinkovým prstem pro rozpoznání rodiny sekvencí DNA 5'-ANN-3 'a jejich použití při konstrukci umělých transkripčních faktorů“. J. Biol. Chem. 276 (31): 29466–78. doi:10,1074 / jbc.M102604200. PMID  11340073.
  12. ^ Christy B, Nathans D (listopad 1989). "DNA vazebné místo proteinu Zif268 indukovatelného růstovým faktorem". Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (22): 8737–41. Bibcode:1989PNAS ... 86.8737C. doi:10.1073 / pnas.86.22.8737. PMC  298363. PMID  2510170.
  13. ^ A b Pavletich NP, Pabo CO (květen 1991). „Rozpoznání zinkového prstu-DNA: krystalová struktura komplexu Zif268-DNA při 2,1 A“. Věda. 252 (5007): 809–17. Bibcode:1991Sci ... 252..809P. doi:10.1126 / science.2028256. PMID  2028256.
  14. ^ Rebar EJ, Pabo CO (únor 1994). „Zinkový prstový fág: výběr afinity prstů s novými specifičnostmi vázání DNA“. Věda. 263 (5147): 671–3. Bibcode:1994Sci ... 263..671R. doi:10.1126 / science.8303274. PMID  8303274.
  15. ^ Jamieson AC, Kim SH, Wells JA (květen 1994). "In vitro výběr zinkových prstů se změněnou specificitou vázání DNA". Biochemie. 33 (19): 5689–95. doi:10.1021 / bi00185a004. PMID  8180194.
  16. ^ Choo Y, Klug A (listopad 1994). „Směrem ke kódu interakcí zinkových prstů s DNA: výběr randomizovaných prstů zobrazených na fágu“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 (23): 11163–7. Bibcode:1994PNAS ... 9111163C. doi:10.1073 / pnas.91.23.11163. PMC  45187. PMID  7972027.
  17. ^ Wu H, Yang WP, Barbas CF (leden 1995). „Budování zinkových prstů výběrem: směrem k terapeutické aplikaci“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (2): 344–8. Bibcode:1995PNAS ... 92..344W. doi:10.1073 / pnas.92.2.344. PMC  42736. PMID  7831288.
  18. ^ Patenty USA 6 140 466, 6 140 081; 6,242,568; 6,610,512; 6,790,941; 7,011,972; 7,067,617; 7,101,972; 7 329 541; 7 151 201; 7,329,728; 7,378,510; 7,442,784; 7 741 110; 7 781 645; 7 833 784; Barbas a kol. vynálezci
  19. ^ Scott, Christopher Thomas (2005). „Monopol na zinkový prst nukleázy“. Přírodní biotechnologie. 23 (8): 915–918. doi:10.1038 / nbt0805-915. PMID  16082353.
  20. ^ Liu Q, Segal DJ, Ghiara JB, Barbas CF (květen 1997). „Návrh polydaktylových proteinů se zinkovým prstem pro jedinečné adresování v komplexních genomech“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (11): 5525–30. Bibcode:1997PNAS ... 94.5525L. doi:10.1073 / pnas.94.11.5525. PMC  20811. PMID  9159105.
  21. ^ Kim JS, Lee HJ, Carroll D (únor 2010). „Úpravy genomu s modulárně sestavenými nukleázami se zinkovým prstem“. Nat. Metody. 7 (2): 91, odpověď autora 91–2. doi:10.1038 / nmeth0210-91a. PMC  2987589. PMID  20111032.
  22. ^ Joung JK, Voytas DF, Cathomen T (únor 2010). „Odpověď na“ Úpravy genomu s modulárně sestavenými nukleázami se zinkovým prstem"". Nat. Metody. 7 (2): 91–2. doi:10.1038 / nmeth0210-91b. PMC  2987589.
  23. ^ A b Shukla VK, Doyon Y, Miller JC a kol. (Květen 2009). „Přesná modifikace genomu u druhů plodin Zea mays pomocí nukleáz se zinkovým prstem“. Příroda. 459 (7245): 437–41. Bibcode:2009 Natur.459..437S. doi:10.1038 / nature07992. PMID  19404259.
  24. ^ Segal DJ, Dreier B, Beerli RR, Barbas CF (březen 1999). „Směrem k libovolné kontrole genové exprese: výběr a design domén se zinkovým prstem rozpoznávajících každou z cílových sekvencí DNA 5'-GNN-3 '“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (6): 2758–63. Bibcode:1999PNAS ... 96.2758S. doi:10.1073 / pnas.96.6.2758. PMC  15842. PMID  10077584.
  25. ^ Dreier B, Fuller RP, Segal DJ a kol. (Říjen 2005). „Vývoj domén se zinkovým prstem pro rozpoznávání sekvencí DNA rodiny 5'-CNN-3 'a jejich použití při konstrukci umělých transkripčních faktorů“. J. Biol. Chem. 280 (42): 35588–97. doi:10,1074 / jbc.M506654200. PMID  16107335.
  26. ^ Dreier B, Beerli RR, Segal DJ, Flippin JD, Barbas CF (srpen 2001). „Vývoj domén se zinkovým prstem pro rozpoznání rodiny sekvencí DNA 5'-ANN-3 'a jejich použití při konstrukci umělých transkripčních faktorů“. J. Biol. Chem. 276 (31): 29466–78. doi:10,1074 / jbc.M102604200. PMID  11340073.
  27. ^ Bae KH, Kwon YD, Shin HC a kol. (Březen 2003). "Lidské zinkové prsty jako stavební kameny při konstrukci umělých transkripčních faktorů". Nat. Biotechnol. 21 (3): 275–80. doi:10.1038 / nbt796. PMID  12592413.
  28. ^ C.L. Ramirez; J. E. Foley; D.A. Wright; F. Muller-Lerch; S.H. Rahman; T.I. Cornu; R.J. Winfrey; J. D. Sander; F. Fu; J.A. Townsend; T. Cathomen; D.F. Voytas; J.K. Joung (2009). "Neočekávaná míra selhání modulární sestavy zinkovaných prstů". Přírodní metody. 5 (5): 374–375. doi:10.1038 / nmeth0508-374. PMID  18446154.
  29. ^ Kim HJ, Lee HJ, Kim H, Cho SW, Kim JS (červenec 2009). „Cílená editace genomu v lidských buňkách pomocí nukleáz zinkových prstů konstruovaných pomocí modulárního sestavení“. Genome Res. 19 (7): 1279–88. doi:10.1101 / gr.089417.108. PMC  2704428. PMID  19470664.
  30. ^ Sander JD, Dahlborg EJ, Goodwin MJ, Cade L, Zhang F, Cifuentes D, Curtin SJ, Blackburn JS, Thibodeau-Beganny S a kol. (2010). „Inženýrství zinku a prstů s nukleázou bez výběru podle kontextově závislé montáže (CoDA)“. Přírodní metody. 8 (1): 67–69. doi:10.1038 / nmeth.1542. PMC  3018472. PMID  21151135.
  31. ^ Greisman HA, Pabo CO (leden 1997). "Obecná strategie pro výběr vysoce afinitních proteinů se zinkovým prstem pro různá cílová místa DNA". Věda. 275 (5300): 657–61. doi:10.1126 / science.275.5300.657. PMID  9005850.
  32. ^ M.L. Maeder; et al. (Září 2008). „Rychlý“ otevřený zdroj „Inženýrství zakázkových nukleáz zinku pro vysoce účinnou úpravu genů“. Mol. Buňka. 31 (2): 294–301. doi:10.1016 / j.molcel.2008.06.016. PMC  2535758. PMID  18657511.
  33. ^ AC Jamieson; J. C. Miller; C.O. Pabo (květen 2003). "Objev drog s upravenými proteiny se zinkovým prstem". Recenze přírody Objev drog. 2 (5): 361–8. doi:10.1038 / nrd1087. PMID  12750739.
  34. ^ Moscou MJ, Bogdanove AJ (prosinec 2009). "Jednoduchá šifra řídí rozpoznávání DNA pomocí TAL efektorů". Věda. 326 (5959): 1501. Bibcode:2009Sci ... 326.1501M. doi:10.1126 / science.1178817. PMID  19933106.
  35. ^ Boch J, Scholze H, Schornack S a kol. (Prosinec 2009). "Porušení kódu vazebné specificity DNA efektorů TAL typu III". Věda. 326 (5959): 1509–12. Bibcode:2009Sci ... 326.1509B. doi:10.1126 / science.1178811. PMID  19933107.
  36. ^ Christian M, Cermak T, Doyle EL a kol. (Červenec 2010). „TAL efektorové nukleázy vytvářejí cílené DNA dvouřetězcové zlomy“. Genetika. 186 (2): 757–761. doi:10.1534 / genetika.110.120717. PMC  2942870. PMID  20660643.
  37. ^ Li T, Huang S, Jiang WZ a kol. (Srpen 2010). „TAL nukleázy (TALN): hybridní proteiny složené z TAL efektorů a FokI DNA-štěpné domény“. Nucleic Acids Res. 39 (1): 359–372. doi:10.1093 / nar / gkq704. PMC  3017587. PMID  20699274.
  38. ^ SC Ekker (2008). „Razicí knoflíky na bázi zinkového prstu pro geny zebrafish“. Zebrafish. 5 (2): 1121–3. doi:10.1089 / zeb.2008.9988. PMC  2849655. PMID  18554175.
  39. ^ D. Carroll (2008). „Pokrok a vyhlídky: Nukleázy se zinkovým prstem jako látky genové terapie“. Genová terapie. 15 (22): 1463–1468. doi:10.1038 / gt.2008.145. PMC  2747807. PMID  18784746.
  40. ^ Geurts AM, Cost GJ, Freyvert Y a kol. (Červenec 2009). „Vyřazení krys mikroinjekcí nukleáz zinkovým prstem do embrya“. Věda. 325 (5939): 433. Bibcode:2009Sci ... 325..433G. doi:10.1126 / science.1172447. PMC  2831805. PMID  19628861.
  41. ^ Tebas, Pablo; et al. (Únor 2009). „Autologní T-buňky geneticky modifikované na genu CCR5 nukleázami zinku Finger SB-728 pro HIV (Zinc-Finger)“. ClinicalTrials.gov.
  42. ^ Beerli RR, Segal DJ, Dreier B, Barbas CF (1998). „Směrem k řízení genové exprese dle libosti: specifická regulace promotoru erbB-2 / HER-2 pomocí polydactylzinkových prstových proteinů konstruovaných z modulárních stavebních bloků“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95 (25): 14628–33. Bibcode:1998PNAS ... 9514628B. doi:10.1073 / pnas.95.25.14628. PMC  24500. PMID  9843940.
  43. ^ Imanishi M, Yan W, Morisaki T, Sugiura Y (2005). „Umělý peptid se šesti zinkovými prsty s polyargininovým linkerem: selektivní vazba na diskontinuální sekvence DNA“. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333 (1): 167–73. doi:10.1016 / j.bbrc.2005.05.090. PMID  15939400.
  44. ^ Wolfe SA, Grant RA, Elrod-Erickson M, Pabo CO (2001). "Kromě" rozpoznávacího kódu ": struktury dvou komplexů Cys2His2 se zinkovým prstem / TATA boxem". Struktura. 9 (8): 717–23. doi:10.1016 / S0969-2126 (01) 00632-3. PMID  11587646.