Počet virtuálních kolonií - Virtual colony count

Počet virtuálních kolonií (VCC) je kinetický, 96 jamek mikrobiologické test původně vyvinut pro měření aktivity defensiny.[1] Od té doby byl použit na jiné antimikrobiální peptidy počítaje v to LL-37.[2] Využívá metodu výčtu bakterií zvanou kvantitativní růstová kinetika, která porovnává čas potřebný k tomu, aby bakteriální dávková kultura dosáhla prahové optické hustoty s prahovou hodnotou optické hustoty. Název VCC byl také použit k popisu aplikace kvantitativní růstové kinetiky pro výčet bakterií v modelech infekce buněčných kultur.[3]Testování antimikrobiální citlivosti (AST) lze provést na 96jamkových destičkách zředěním antimikrobiální činidlo v různých koncentracích v bujónu naočkovaném bakterie a měření minimální inhibiční koncentrace což nemá za následek žádný růst. Tyto metody však nelze použít ke studiu některých membránově aktivních látek antimikrobiální peptidy, které jsou inhibovány samotným vývarem. Postup počítání virtuálních kolonií využívá této skutečnosti tím, že nejprve vystaví bakteriální buňky aktivnímu antimikrobiálnímu činidlu v nízko solném nárazník po dobu dvou hodin, pak současně inhibuje a vyvolává antimikrobiální aktivitu exponenciální růst přidáním vývaru. The kinetika růstu přeživších buněk pak lze monitorovat pomocí teploty čtečka desek.

Kinetika kvantitativního růstu

Kalibrační křivky VCC

Metoda výčtu[4] přežívajících buněk používaných VCC se nazývá kvantitativní růstová kinetika (QGK). Vztahuje se kinetický čas potřebný pro zákal bakteriální šarže mikrobiologická kultura ve studni 96-jamkové mikrodestička k dosažení prahového rozdílu v zákalu na 10násobnou sérii ředění kalibračních růstových křivek.

Kvantifikace počtu životaschopných buněk se provádí pomocí procesu matematicky identického s kvantitativním polymerázová řetězová reakce v reálném čase (QPCR), s výjimkou QGK buňky, spíše než kopie produktů PCR, rostou exponenciálně. Čas potřebný k dosažení prahové hodnoty se nazývá „prahová doba“, Tt, což je ekvivalentní s QPCR hodnota „doba cyklu“ nebo Ct.

Existuje nejméně pět procesů, které způsobují zpoždění prahových časů v testech VCC:

1. Adheze, způsobení ulpívání buněk na mikrodestičce a případně tvorby biofilmy. Pokud tyto buňky nejsou přímo ve světelné dráze, jejich růst nebude mít vliv na hodnoty optické hustoty.

2. Soudržnost způsobující shlukování buněk do shluků různých velikostí namísto homogenní suspenze jednotlivých buněk procházejících binární dělení. Soudržnost může způsobit nepřesnost a kolísání Tt. Soudržné shluky mohou být také adhezivní, což vede k nepřesnosti v důsledku soudržnosti a nepřesnosti (zvýšené Tt) kvůli adhezi.

3. Bakteriostatický aktivita, která způsobí, že buňky nebudou schopny vstoupit do exponenciálního růstu, i když nejsou zabity. Přechodná bakteriostatická aktivita může způsobit prodlevu, což zvyšuje Tt.

4. Fáze metabolického zpoždění bakteriální růst. Očekává se, že k takové zpožďovací fázi dojde v testu, protože buňky, které rostou pomalu nebo vůbec ne během počáteční expozice antimikrobiálním peptidům v pufru s nízkým obsahem soli, se po přidání dvakrát koncentrovaného bohatého média posunou k exponenciálnímu růstu. Pokud se tato metabolická zpožďovací fáze zvýší v přítomnosti antimikrobiálního peptidu, mohlo by to být považováno za formu přechodné bakteriostatické aktivity v kategorii 3 výše, ačkoli jiné zdroje přechodné bakteriostatické aktivity, jako je zpoždění kvůli času potřebnému pro opravu poškozených buněčných struktur, jako je buněčné stěny nebo buněčné membrány, jsou možné.

5. Baktericidní činnost nebo zabíjení. Méně přežívajících buněk způsobuje zpoždění Tt protože přeživším trvá déle, než produkují stejné množství zákalu exponenciálním růstem. Pokud všechny ostatní procesy způsobující zvýšení Tt jsou zanedbatelné, test VCC se stává baktericidním testem a Tt lze použít k výčtu životaschopných bakterií pomocí QGK. V tomto zjednodušeném případě jsou výsledky „virtuálního přežití“ VCC ekvivalentní s výsledky „přežití“ tradičního baktericidního testu na počet kolonií.

Bakterie

K kvantifikaci antibakteriální aktivity peptidů proti šesti kmenům kmene VCC byl původně použit VCC Escherichia coli, Zlatý stafylokok, Bacillus cereus, a Enterobacter aerogenes.[1] Obvykle standard Gramnegativní a Grampozitivní kontrola kvality kmen jsou porovnány. Escherichia coli ATCC 25922 a Zlatý stafylokok Jako standardní gramnegativní a grampozitivní kmeny byly použity ATCC 29213. VCC byl také použit Bacillus anthracis, původce antrax.[5]

Antimikrobiální peptidy

Počáteční studie počtu virtuálních kolonií měřila aktivitu všech šesti lidí alfa defensiny souběžně na stejné 96jamkové destičce: HNP1, HNP2, HNP3, HNP4, HD5, a HD6.[1] Následně zmutovaný formy některých z těchto šesti defensinů byly studovány pomocí VCC. Konzervovaný glycin v beta boule v HNP2 byl nahrazen řadou D-aminokyseliny což má za následek aktivitu VCC úměrnou postrannímu řetězci hydrofobicita a účtovat.[6] VCC ukázala, že N-terminálně acetylovaná a / nebo C-terminálně amidovaná aktivita HNP2 je úměrná elektrostatický nabít.[7] Výsledky VCC byly opět úměrné poplatku za sérii mutantů narušujících solný můstek, což naznačuje, že solný můstek není pro funkci HNP2 vyžadován.[8] VCC měřila význam N-koncových přírodních a umělých pro segmentů propeptid HNP1, dramaticky měnící aktivitu proti Escherichia coli a Zlatý stafylokok.[9][10] Enantiomer formy HNP1, HNP4, HD5 a beta defensin HBD2 složený výhradně z D-aminokyselin navrhl odlišné mechanismy aktivity defensinu proti Grampozitivní a Gramnegativní bakterie.[11] Výsledky VCC u monomerních a vázaných dimerních forem HNP1 se sníženou dimerací prokázaly důležitost dimerizace.[12] Nahrazení konzervovaného glycinu L-alanin vedlo k jemným rozdílům VCC.[13] Obsáhlý skenování alaninu mutageneze HNP1[14][15] a HD5[16] prokázal význam objemných hydrofobních zbytků. Tyto studie byly nedávno rozšířeny o další beta defensiny, theta defensiny,[5] a lidský katelicidin LL-37 a příbuzné peptidy.[2]

Bezpečné a efektivní pipetování

Uživatelé VCC jsou varováni, aby přenášeli buňky v malém objemu, jako je 10 mikrolitrů, pod větší objem, jako je 90 mikrolitrů, podobně jako výše uvedené kalibrační křivky QGK a kalibrační křivky uvedené v původní publikaci VCC,[1] ale na rozdíl od experimentálního postupu použitého k testování aktivity defensinu ve stejném článku. Vylepšené pipetování Tato technika byla popsána v roce 2011 ve studii biologická bezpečnost úroveň 3 (BSL-3) patogen Bacillus anthracis.[5] Původní metoda publikovaná v roce 2005 zahrnovala přenos 50 mikrolitrů buněčných suspenzí na 50 mikrolitrů kapaliny, což vytváří pěnu, bubliny a zákal, který je nekompatibilní s turbidimetrickou metodou, když jsou buňky přeneseny přímo do dna jamek pod fosfátovým pufrem řešení. Vyhněte se tomuto problému přidáním suspenzí buněk, protože to mohou způsobit kapičky shora aerosoly které vedou ke křížové kontaminaci.[17] Bioaerosoly nebezpečných bakterií může také představovat bezpečnostní rizika, která lze snížit prováděním experimentů v rámci a skříň pro biologickou bezpečnost.

Reference

  1. ^ A b C d Ericksen B, Wu Z, Lu W, Lehrer RI (2005). „Antibakteriální aktivita a specificita šesti lidských α-defensinů“. Antimicrob. Agenti Chemother. 49 (1): 269–75. doi:10.1128 / AAC.49.1.269-275.2005. PMC  538877. PMID  15616305.
  2. ^ A b Pazgier M, Ericksen B, Ling M, Toth EA, Shi J, Li X, Galliher-Beckley A, Lan L, Zou G, Zhan C, Yuan W, Pozharski E, Lu W (2013). „Strukturální a funkční analýza pro-domény lidského katelicidinu, LL-37“. Biochemie. 52 (9): 1547–58. doi:10.1021 / bi301008r. PMC  3634326. PMID  23406372.
  3. ^ Hoffmann S, Walter S, Blume AK, Fuchs S, Schmidt C, Scholz A, Gerlach RG (2018). „Vysoce výkonná kvantifikace interakcí bakteriálních buněk pomocí počtu virtuálních kolonií“. Mikrobiol infikovaný přední buňkou. 8 (43). doi:10.3389 / fcimb.2018.00043. PMC  5818393. PMID  29497603.
  4. ^ Brewster, JD. (2003). "Jednoduchý test mikro-růstu pro stanovení počtu bakterií". J Microbiol Methods. 53 (1): 77–86. doi:10.1016 / S0167-7012 (02) 00226-9. PMID  12609726.
  5. ^ A b C Welkos S, Cote CK, Hahn U, Shastak O, Jedermann J, Bozue J, Jung G, Ruchala P, Pratikhya P, Tang T, Lehrer RI, Beyer W (2011). „Humanizované theta-defensiny (retrocykliny) zvyšují výkon makrofágů a chrání myši před experimentálními antraxovými infekcemi“. Antimicrob. Agenti Chemother. 55 (9): 4238–50. doi:10.1128 / AAC.00267-11. PMC  3165295. PMID  21768520.
  6. ^ Xie C, Prahl A, Ericksen B, Wu Z, Zeng P, Li X, Lu WY, Lubkowski J, Lu W (2005). "Rekonstrukce konzervované beta-boule v savčích defensinech pomocí D-aminokyselin". J Biol Chem. 280 (38): 32921–9. doi:10,1074 / jbc.M503084200. PMID  15894545.
  7. ^ Xie C, Zeng P, Ericksen B, Wu Z, Lu WY, Lu W (2005). "Účinky koncových nábojů v lidském neutrofilu alfa-defensinu 2 na jeho baktericidní a membránovou aktivitu". Peptidy. 26 (12): 2377–83. doi:10.1016 / j.peptides.2005.06.002. PMID  16009464.
  8. ^ Wu Z, Li X, de Leeuw E, Ericksen B, Lu W (2005). „Proč je solný můstek Arg5-Glu13 konzervován v savčích alfa-defensinech?“. J Biol Chem. 280 (52): 43039–47. doi:10,1074 / jbc.M510562200. PMID  16246847.
  9. ^ Wu Z, Li X, Ericksen B, de Leeuw E, Zou G, Zeng P, Xie C, Li C, Lubkowski J, Lu WY, Lu W (2007). „Dopad pro segmentů na skládání a funkci lidských neutrofilních alfa-defensinů“. J Mol Biol. 368 (2): 537–49. doi:10.1016 / j.jmb.2007.02.040. PMC  2754399. PMID  17355880.
  10. ^ Zou G, de Leeuw E, Lubkowski J, Lu W (2008). "Molekulární determinanty pro interakci lidského neutrofilu alfa defensinu 1 s jeho propeptidem". J Mol Biol. 381 (5): 1281–91. doi:10.1016 / j.jmb.2008.06.066. PMC  2754386. PMID  18616948.
  11. ^ Wei G, de Leeuw E, Pazgier M, Yuan W, Zou G, Wang J, Ericksen B, Lu WY, Lehrer RI, Lu W (2009). „Přes zrcadlo, mechanické pohledy z enantiomerních lidských defensinů“. J Biol Chem. 284 (42): 29180–92. doi:10.1074 / jbc.M109.018085. PMC  2781462. PMID  19640840.
  12. ^ Pazgier M, Wei G, Ericksen B, Jung G, Wu Z, de Leeuw E, Yuan W, Szmacinski H, Lu WY, Lubkowski J, Lehrer RI, Lu W (2012). „Někdy je zapotřebí tanga dva: příspěvky dimerizace k funkcím lidského peptidu HNP1 s α-defensinem“. J Biol Chem. 287 (12): 8944–53. doi:10.1074 / jbc.M111.332205. PMC  3308808. PMID  22270360.
  13. ^ Zhao L, Ericksen B, Wu X, Zhan C, Yuan W, Li X, Pazgier M, Lu W (2012). „Invariantní gly zbytek je důležitý pro skládání, dimerizaci a funkci α-defensinu: případová studie lidského neutrofilu α-defensinu HNP1“. J Biol Chem. 287 (23): 18900–12. doi:10.1074 / jbc.M112.355255. PMC  3365925. PMID  22496447.
  14. ^ Wei G, Pazgier M, de Leeuw E, Rajabi M, Li J, Zou G, Jung G, Yuan W, Lu WY, Lehrer RI, Lu W (2010). „Trp-26 dodává lidskému alfa-defensinu HNP1 funkční univerzálnost“. J Biol Chem. 285 (21): 16275–85. doi:10.1074 / jbc.M110.102749. PMC  2871495. PMID  20220136.
  15. ^ Zhao L, Tolbert WD, Ericksen B, Zhan C, Wu X, Yuan W, Li X, Pazgier M, Lu W (2013). „Jednoduché, dvojité a čtyřnásobné substituce alaninu v oligomerních rozhraních identifikují hydrofobicitu jako klíčový determinant funkce lidského neutrofilu alfa-defensinu HNP1“. PLOS ONE. 8 (11): e78937. doi:10.1371 / journal.pone.0078937. PMC  3827289. PMID  24236072.
  16. ^ Rajabi M, Ericksen B, Wu X, de Leeuw E, Zhao L, Pazgier M, Lu W (2012). „Funkční determinanty lidského enterického α-defensinu HD5: klíčová role hydrofobicity na rozhraní dimeru“. J Biol Chem. 287 (26): 21615–27. doi:10.1074 / jbc.M112.367995. PMC  3381126. PMID  22573326.
  17. ^ Ericksen B (2014). „Bezpečnost, účinnost a užitečnost metod přenosu adhezivních a soudržných buněk Escherichia coli na mikrodesky, aby se zabránilo aerosolům“. F1000Res. 3: 267. doi:10.12688 / F1000Research.5659.2. PMC  4309163. PMID  25671086.

externí odkazy