Techniky izolace hematopoetických kmenových buněk - Techniques to isolate haematopoietic stem cells

Od té doby hematopoetické kmenové buňky nelze izolovat jako čistou populaci, není možné je identifikovat v mikroskopu.[Citace je zapotřebí ] Existuje tedy mnoho techniky pro izolaci hematopoetických kmenových buněk (HSC). HSC lze identifikovat nebo izolovat pomocí průtoková cytometrie kde se kombinace několika různých markerů buněčného povrchu používá k oddělení vzácných HSC od okolních krevních buněk. HSC postrádají expresi markerů zralých krevních buněk a proto se jim říká Lin-. Nedostatek exprese markerů linie se používá v kombinaci s detekcí několika pozitivních markerů buněčného povrchu k izolaci HSC. HSC se navíc vyznačují svou malou velikostí a nízkým barvením vitálními barvivy, jako je rhodamin 123 (rhodamin hle) nebo Hoechst 33342 (vedlejší populace).

Shluk diferenciace a další markery

Klasickým markerem lidského HSC je CD34, který poprvé popsal nezávisle Civin et al. a Tindle a kol.[1][2][3][4] Používá se k izolaci HSC k rekonstituci pacientů, kteří jsou hematologicky nekompetentní v důsledku chemoterapie nebo onemocnění.

Mnoho značek patří k shluk diferenciace série, jako: CD34, CD38, CD90, CD133, CD105, CD45, a také c-kit - receptor pro faktor kmenových buněk.

Existuje mnoho rozdílů mezi markery lidské a myší hematopoetické buňky pro běžně přijímaný typ hematopoetických kmenových buněk.[5]

Avšak ne všechny kmenové buňky jsou pokryty těmito kombinacemi, které se nicméně staly populární. Ve skutečnosti dokonce i u lidí existují krvetvorné kmenové buňky CD34−/CD38−.[6][7] Také některé pozdější studie naznačují, že v nejranějších kmenových buňkách může na povrchu buněk chybět c-kit.[8] Pro lidské HSC použití CD133 byl o krok napřed jako oba CD34+ a CD34− HSC byly CD133+.

Tradiční metoda čištění použitá k získání přiměřené úrovně čistoty myších hematopoetických kmenových buněk obecně vyžaduje velkou (~ 10–12) baterii markerů, z nichž většina byly náhradní markery s malým funkčním významem, a tedy částečné překrývání s kmenem buněčné populace a někdy i jiné blízce příbuzné buňky, které nejsou kmenovými buňkami. Některé z těchto značek (např. Thy1 ) nejsou konzervovány napříč druhy myší a použití markerů jako CD34− pro čištění HSC vyžaduje, aby myši byly staré alespoň 8 týdnů.

SLAM kód

Alternativní metody, které by mohly vést k podobné nebo lepší sklizni kmenových buněk, jsou aktivní oblastí výzkumu a v současnosti jsou[když? ] objevující se. Jedna taková metoda používá podpis SLAM rodinné buněčné povrchové molekuly. SLAM (Signalizující molekula aktivace lymfocytů ) rodina je skupina více než 10 molekul, jejichž geny jsou umístěny většinou tandemově v jednom lokusu na chromozomu 1 (myš), všechny patří do podskupiny nadrodiny imunoglobulinových genů a původně se předpokládalo, že se účastní stimulace T-buněk. Tato rodina zahrnuje CD48, CD150, CD244 atd., CD150 je zakládajícím členem, a tedy také známý jako slamF1, tj. člen rodiny SLAM 1.

Podpis SLAM kódy pro hemopoetickou hierarchii jsou:

Pro HSC CD150+CD48− místo toho stačilo CD150+CD48−CD244− protože CD48 je ligand pro CD244 a oba by byly pozitivní pouze u aktivovaných původců omezených na linii. Zdá se, že tento kód byl efektivnější než zdlouhavá dřívější sada velkého počtu markerů a je také zachován napříč kmeny myší; nedávná práce však ukázala, že tato metoda vylučuje velké množství HSC a zahrnuje stejně velký počet ne kmenových buněk.[9][10] CD150+CD48− dal čistotu kmenových buněk srovnatelnou s Thy1hleSCA-1+lin−c-kit+ u myší.[11]

LT-HSC / ST-HSC / časný MPP / pozdní MPP

Irving Weissman je skupina v Stanfordská Univerzita byl první, kdo izoloval myší hematopoetické kmenové buňky v roce 1988[12] a byl také první, kdo vypracoval markery pro rozlišení myší dlouhodobých (LT-HSC) a krátkodobých (ST-HSC) hematopoetických kmenových buněk (schopných samoobnovy) a multipotentních progenitorů (MPP, nízké nebo žádná schopnost samoobnovy - čím později je vývojová fáze MPP, tím menší je schopnost samoobnovy a tím více značek jako CD4 a CD135 ):

Reference

  1. ^ Civin CI. Strauss LC. Brovall C. Fackler MJ. Schwartz JF. Shaper JH. (1984). „Antigenní analýza hematopoézy: III. Povrchový antigen hematopoetických buněk definovaný monoklonální protilátkou vytvořenou proti buňkám KG-1a“. Journal of Immunology. 133 (1): 157–65.
  2. ^ Tindle RW, Nichols RA, Chan L, Campana D, Catovsky D, Birnie GD (1985). „Nová monoklonální protilátka BI-3C5 rozpoznává myeloblasty a non-B non-T lymfoblasty při akutních leukémiích a CGL blast krizích a reaguje s nezralými buňkami v normální kostní dřeni“. Výzkum leukémie. 9 (1): 1–9. doi:10.1016/0145-2126(85)90016-5. PMID  3857402.
  3. ^ Tindle RW, Katz F, Martin H, Watt S, Catovsky D, Janossy G, Greaves M (1987). „BI-3C5 (CD34) definuje multipotenciální a linie omezené progenitorové buňky a jejich leukemické protějšky“. Typizace leukocytů III: diferenciační antigeny bílých buněk: 654–55.
  4. ^ Loken MR, Shah VO, Civin CI (1987). "Charakterizace myeloidních antigenů na lidské kostní dřeni pomocí vícebarevné imunofluorescence". Typizace leukocytů III: diferenciační antigeny bílých buněk. str. 630–35.
  5. ^ „Stemcells Redirection“. stemcells.nih.gov.
  6. ^ Bhatia M, Bonnet D, Murdoch B, Gan OI, Dick JE (září 1998). „Nově objevená třída lidských hematopoetických buněk s aktivitou repopulace SCID“. Přírodní medicína. 4 (9): 1038–45. doi:10.1038/2023. PMID  9734397.
  7. ^ Guo Y, Lübbert M, Engelhardt M (2003). „CD34- hematopoetické kmenové buňky: současné koncepty a diskuse“. Kmenové buňky. 21 (1): 15–20. doi:10.1634 / kmenové články.21-1-15. PMID  12529547.
  8. ^ Doi H, Inaba M, Yamamoto Y, Taketani S, Mori SI, Sugihara A, Ogata H, Toki J, Hisha H, Inaba K, Sogo S, Adachi M, Matsuda T, Good RA, Ikehara S (březen 1997). „Pluripotentní hemopoetické kmenové buňky jsou c-kit . Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 94 (6): 2513–7. Bibcode:1997PNAS ... 94.2513D. doi:10.1073 / pnas.94.6.2513. PMC  20119. PMID  9122226.
  9. ^ Weksberg DC, Chambers SM, Boles NC, Goodell MA (únor 2008). „Populační buňky na straně CD150 představují funkčně odlišnou populaci dlouhodobých hematopoetických kmenových buněk“. Krev. 111 (4): 2444–51. doi:10.1182 / krev-2007-09-115006. PMC  2234069. PMID  18055867.
  10. ^ Van Zant G (2005). „Značky kmenových buněk: méně je více!“. Krev. 107 (3): 855–56. doi:10.1182 / krev-2005-11-4400.
  11. ^ Kiel MJ, Yilmaz OH, Iwashita T, Yilmaz OH, Terhorst C, Morrison SJ (červenec 2005). „SLAM rodinné receptory rozlišují hematopoetické kmenové a progenitorové buňky a odhalují endoteliální výklenky pro kmenové buňky“. Buňka. 121 (7): 1109–21. doi:10.1016 / j.cell.2005.05.026. PMID  15989959.
  12. ^ Spangrude GJ, Heimfeld S, Weissman IL (červenec 1988). "Čištění a charakterizace myších krvetvorných kmenových buněk". Věda. 241 (4861): 58–62. PMID  2898810.