Stabilní lipidová částice nukleové kyseliny - Stable nucleic acid lipid particle - Wikipedia

Struktura SNALP

Stabilní lipidové částice nukleové kyseliny (SNALP) jsou mikroskopické částice přibližně 120 nanometry v průměru, menší než vlnové délky viditelného světla. Byly použity k doručení siRNA terapeuticky savcům in vivo. V SNALP je siRNA obklopena a lipidová dvojvrstva obsahující směs kationtový a fusogenní lipidy potažené difuzní polyethylenglykol.[1]

Úvod

Interference RNA (RNAi) je proces, který se přirozeně vyskytuje v cytoplazmě a inhibuje genovou expresi ve specifických sekvencích. Regulace genové exprese prostřednictvím RNAi je možná zavedením malé interferující RNA (siRNA), které účinně umlčují expresi cílového genu. RNAi aktivuje Komplex umlčování vyvolaný RNA (RISC) obsahující siRNA, siRNA odvozená ze štěpené dsRNA. SiRNA vede komplex RISC ke specifické sekvenci na mRNA, která je štěpena RISC, a následně tyto geny umlčuje.[2]

Avšak bez modifikace páteře RNA nebo zahrnutí invertovaných bází na obou koncích nestabilita siRNA v plazmě extrémně obtížně aplikuje tuto techniku in vivo. Receptory rozpoznávání vzorů (PRR), které lze seskupit jako endocytické PRR nebo signalizační PRR, jsou exprimovány ve všech buňkách vrozený imunitní systém. Mezi signální PRR patří zejména Mýtné receptory (TLR) a jsou zapojeny především do identifikace s patogeny spojené molekulární vzorce (PAMP). Například TLR mohou rozpoznávat specifické oblasti konzervované v různých patogenech, rozpoznávání stimulující imunitní odpověď s potenciálně ničivými účinky na organismus. Zejména, TLR 3 uznává obojí dsRNA charakteristická pro virovou replikaci a siRNA, která je také dvouvláknová.[3] Kromě této nestability se další omezení terapie siRNA týká neschopnosti cílit na tkáň s jakoukoli specificitou.

SNALP však mohou poskytnout stabilitu a specificitu požadovanou pro efektivní způsob léčby RNAi. Skládající se z lipidová dvojvrstva „SNALP jsou schopny poskytnout stabilitu siRNA tím, že je chrání před nukleázami v plazmě, které by je degradovaly. Kromě toho podléhá dodání siRNA endozomální obchodování s lidmi a potenciálně je vystavit TLR3 a TLR7 a může vést k aktivaci interferony a prozánětlivé cytokiny. SNALP však umožňují absorpci siRNA do endozom bez aktivace Mýtné receptory a následně stimulace bránící imunitní odpovědi, což umožňuje únik siRNA z endosomu.[1]

Vývoj dodávek siRNA SNALP

Downregulace genové exprese prostřednictvím siRNA byla důležitým nástrojem výzkumu v in vitro studie. Citlivost siRNA na degradaci nukleáz je však využívá in vivo problematický. V roce 2005 spolupracovali výzkumní pracovníci s virus hepatitidy B. (HBV) u hlodavců stanoveno, že určité modifikace siRNA zabraňovaly degradaci pomocí nukleázy v plazmě a vést ke zvýšenému umlčení genu ve srovnání s nemodifikovanou siRNA. Úpravy smysl a antisense prameny byly vyrobeny odlišně. Pokud jde o sense i antisense řetězce, byl 2'-OH vůbec substituován 2'-fluorem pyrimidin pozic. Kromě toho byly smyslové řetězce vůbec upraveny purin pozice s deoxyribózou, antisense vlákna modifikovaná 2'-Ó-methyl na stejných pozicích. 5 'a 3' konce smyslového řetězce byly uzavřeny abazickými obrácenými opakováními, zatímco a fosforothioát vazba byla začleněna na 3 'konec antisense vlákna.[4]

Ačkoli tento výzkum prokázal potenciální terapii RNAi pomocí modifikované siRNA, 90% snížení HBV DNA u hlodavců vyplynulo z dávky 30 mg / kg s častým podáváním. Protože se nejedná o životaschopný režim dávkování, sledovala stejná skupina účinky zapouzdření siRNA v PEGylovaný lipidová dvojvrstva nebo SNALP. Konkrétně lipidová dvojvrstva usnadňuje absorpci do buňky a následné uvolňování z endosomu, přičemž PEGylovaná vnější vrstva poskytuje stabilitu během formulace díky výslednému hydrofilnost exteriéru. Podle této studie z roku 2005 vědci dosáhli 90% snížení HBV DNA s dávkou 3 mg / kg / den siRNA po dobu tří dnů, což je dávka podstatně nižší než v dřívější studii. Kromě toho na rozdíl od nemodifikované nebo modifikované a nezapouzdřené siRNA nevedlo podávání siRNA dodávané SNALP k žádným detekovatelným hladinám interferony, jako je IFN-a, nebo zánětlivý cytokiny spojené s imunostimulací. Vědci přesto uznali, že k dosažení proveditelné dávky a režimu dávkování je zapotřebí více práce.[5]

V roce 2006 vědci pracující na umlčení apolipoprotein B (ApoB) u subhumánních primátů dosáhlo 90% umlčení jedinou dávkou 2,5 mg / kg siRNA specifické pro APOB specifickou pro SNALP. ApoB je protein zapojený do shromažďování a sekrece lipoprotein s velmi nízkou hustotou (VLDL) a lipoprotein s nízkou hustotou (LDL), a je vyjádřen především v játra a jejunum. VLDL i LDL jsou důležité v cholesterol transport a jeho metabolismus. Nejenže byl tento stupeň umlčení pozorován velmi rychle, asi za 24 hodin po podání, ale účinky umlčování přetrvávaly po dobu 22 dnů i po jediné dávce. Vědci také testovali jednorázovou dávku 1 mg / kg, přičemž bylo dosaženo 68% umlčení cílového genu, což naznačuje umlčení závislé na dávce. Toto umlčování závislé na dávce bylo evidentní nejen na stupni umlčování, ale i na délce umlčování, exprese cílového genu se zotavila 72 hodin po podání.[6]

Ačkoli SNALP s průměrem 100 nm byly účinně použity k cílení specifických genů pro umlčení, existuje celá řada systémových bariér, které se týkají konkrétně velikosti. Například difúzi do pevných nádorů brání velké SNALP a podobně zanícené buňky se zvýšenou permeací a retencí ztěžují vstup velkým SNALP. Navíc, retikuloendoteliální odstranění, hematoencefalická bariéra velikostní selektivita a omezení kapiláry fenestrae všechny vyžadují menší SNALP, aby bylo možné účinně dodávat cílovou specifickou siRNA. V roce 2012 vyvinuli vědci v Německu to, co nazývali „mono-NALP“, pomocí poměrně jednoduché metody výměny rozpouštědel zahrnující progresivní ředění 50% roztoku isopropanolu. Výsledkem je velmi stabilní doručovací systém podobný tradičním SNALP, ale s průměrem pouze 30 nm. Zde vyvinuté mono-NALP jsou neaktivní, ale mohou se stát aktivními nosiči implementací specifických mechanismů cílení a uvolňování používaných podobnými doručovacími systémy.[7]

Aplikace

Virus Zaire Ebola (ZEBOV)

Byli jsme schopni udělit úplnou ochranu buď seskupením siRNA zapouzdřených v SNALP, nebo jednotlivými siRNA SNALP, v závislosti na jejich relativní síle ... [nejsilnější siRNA] ... udělil absolutní ochranu, to je 100 procent přežití, a také přispěl k úplné aviremii u infikovaných morčat. Nebyl tedy detekovatelný virus Ebola, i když byla zvířata naočkována v podstatě 30 000násobkem smrtelné infekční dávky viru.

— Thomas Geisbert, USAMRIID, Květen 2006[8]

V květnu 2010 byla aplikace SNALP na Ebola Virus Zaire dělal titulky, protože přípravek byl schopen léčit makaků rhesus při podání krátce po expozici smrtelné dávce viru, která může být až 90% smrtelná pro člověka při sporadických ohniscích v Africe. Léčba použitá u makaků rhesus sestávala ze tří siRNA (střídaných duplexů RNA) zaměřených na tři virové geny. SNALP (zde mají velikost přibližně 81 nm) byly formulovány spontánní vesikulací ze směsi cholesterol, dipalmitoyl fosfatidylcholin, 3-N - [(co-methoxypoly (ethylenglykol) 2000) karbamoyl] -1,2-dimyrestyloxypropylamin a kationtový 1,2-dilinoleyloxy-3-N, N-dimethylaminopropan.[9]

Navíc k makak rhesus aplikace SNALP také prokázalo, že chrání cavia porcellua z virémie a smrt při podání krátce po postexpozici ZEBOVU. Systém dodání siRNA specifický pro polymerázu (L) byl uložen na čtyři geny spojené s virovou genomovou RNA v komplexu ribonukleoproteinů nalezených v EBOV částicích (tři z nich odpovídají výše uvedené aplikaci): NP, VP30, VP35 a L protein . Velikost SNALP byla v rozmezí od 71 do 84 nm a byly složeny ze syntetického cholesterolu, fosfolipidu DSPC, PEG lipidu PEGC-DMA a kationtového lipidu DLinDMA v molárním poměru 48: 20: 2: 30.[10] Výsledky potvrzují úplnou ochranu před viremií a smrtí u morčat, pokud je jim po diagnostice viru Ebola podán dodávací systém SNALP-siRNA, což dokazuje, že tato technologie je účinnou léčbou. Budoucí studie se zaměří hlavně na hodnocení účinků siRNA „koktejlů“ na geny EBOV za účelem zvýšení antivirových účinků.[10]

Hepatocelulární karcinom

V roce 2010 vědci vyvinuli použitelnou cílenou terapii pro hepatocelulární karcinom (HCC) u lidí. Jako terapeutický cíl pro indukci siRNA byla použita identifikace CSN5, páté podjednotky signalosomového komplexu COP9 nalezené na počátku HCC. Systémové dodávání modifikované CSN5siRNA zapouzdřené v SNALPs významně inhibovalo růst jaterních nádorů v modelu ortotopického xenograftu lidské rakoviny jater Huh7-luc +. Bylo také prokázáno, že knockdown CSN5 zprostředkovaný SiRNA inhibuje progresi buněčného cyklu a zvyšuje rychlost apoptóza v buňkách HCC in vitro. Tyto výsledky nejen prokazují úlohu CSN5 v progresi rakoviny jater, ale také naznačují, že CSN5 má zásadní roli v patogenezi HCC. Závěrem lze říci, že se ukázalo, že SNALP významně snižují růst nádoru hepatocelulárního karcinomu v lidských buňkách Huh7-luc * prostřednictvím terapeutického umlčování.[11]

Nádory

V roce 2009 vědci vyvinuli siRNA schopné cílit jak na pólo-podobnou kinázu 1 (PLK1 ) a kinesin vřetenový protein (KSP). Oba proteiny jsou důležité pro buněčný cyklus nádorových buněk, kterých se účastní PLK1 fosforylace různých proteinů a KSP nedílnou součástí chromozóm segregace během mitóza. Konkrétně bipolární mitotická vřetena nejsou schopny se tvořit, když je inhibována KSP, což vede k zastavení buněčného cyklu a nakonec apoptóza. Podobně inhibice PLK1 usnadňuje mitotické zástavy a buněčnou apoptózu. Podle studie vedla dávka 2 mg / kg PLK1-specifické siRNA podávaná po dobu 3 týdnů myším s implantovanými nádory k prodloužení doby přežití a zjevné redukci nádorů. Ve skutečnosti byl medián doby přežití léčených myší 51 dní na rozdíl od 32 dnů u kontrol. Dále pouze 2 ze 6 léčených myší měly znatelné nádory kolem místa implantace. I tak, GAPDH, signál odvozený z nádoru, byl přítomen na nízkých úrovních, což naznačuje významné potlačení růstu nádoru, ale ne úplnou eliminaci. Výsledky přesto naznačovaly minimální toxicita a žádná významná dysfunkce kostní dřeně. Také zvířata ošetřená KSP-specifickou siRNA vykazovala prodlouženou dobu přežití 28 dnů ve srovnání s 20 dny u kontrol.[12]

Reference

  1. ^ A b J.J. Rossi (2006). "RNAi therapeutics: SNALPing siRNAs in vivo". Genová terapie. 13 (7): 583–584. doi:10.1038 / sj.gt.3302661. PMID  17526070.
  2. ^ Zhang, Shubiao; Defu Zhi; Leaf Huang (2012). "Vektory založené na lipidech pro dodávání siRNA". Journal of Drug Targeting. 20 (9): 724–735. doi:10.3109 / 1061186X.2012.719232. PMC  5006685. PMID  22994300.
  3. ^ Whitehead, Kathryn; James E. Dahlman; Robert S. Langer; Daniel G. Anderson (2011). "Ztlumení nebo stimulace? Dodávka siRNA a imunitní systém". Roční přehled chemického a biomolekulárního inženýrství. 2: 77–96. doi:10.1146 / annurev-chembioeng-061010-114133. PMID  22432611.
  4. ^ Morrissey, David; Blanchard, K .; Shaw, L .; Jensen, K .; Lockridge, J. A .; Dickinson, B .; McSwiggen, J. A .; Vargeese, C .; Bowman, K .; Shaffer, C. S .; Polisky, B. A .; Zinnen, S. (2005). "Aktivita stabilizované krátké interferující RNA v myším modelu replikace viru hepatitidy B". Hepatologie. 41 (6): 1349–1356. doi:10.1002 / hep.20702. PMID  15880588.
  5. ^ Morrissey DV, Lockridge JA, Shaw L, Blanchard K, Jensen K, Breen W, Hartsough K, Machemer L, Radka S, Jadhav V, Vaish N, Zinnen S, Vargeese C, Bowman K, Shaffer CS, Jeffs LB, soudce A , MacLachlan I, Polisky B (2005). „Silná a perzistentní in vivo anti-HBV aktivita chemicky modifikovaných siRNA“. Přírodní biotechnologie. 23 (8): 1002–1007. doi:10.1038 / nbt1122. PMID  16041363.
  6. ^ Zimmermann, Tracy S .; Lee, Amy C. H .; Akinc, Akin; Bramlage, Birgit; Bumcrot, David; Fedoruk, Matthew N .; et al. (2006). „Umlčení genů zprostředkovaných RNAi u primátů (kromě člověka)“. Příroda. 441 (7089): 111–114. Bibcode:2006 Natur.441..111Z. doi:10.1038 / příroda04688. ISSN  0028-0836. PMID  16565705.
  7. ^ Rudorf, Sofie; Joachim O. Radler (2012). „Samosestavení stabilních lipidových částic monomolekulární nukleové kyseliny o velikosti 30 nm“. Journal of the American Chemical Society. 134 (28): 11652–11658. doi:10.1021 / ja302930b. PMID  22694262.
  8. ^ „Protiva's MacLachlan and USAMRIID's Geisbert on SNALPS, siRNAs, and Ebola“. Zprávy RNAi. 18. 05. 2006.
  9. ^ Thomas W. Geisbert; et al. (2010). „Postexpoziční ochrana subhumánních primátů proti smrtelné výzvě viru Ebola s interferencí RNA: studie o důkazu koncepce“. Lancet. 375 (9729): 1896–905. doi:10.1016 / S0140-6736 (10) 60357-1. PMC  7138079. PMID  20511019. (zdarma s registrací)
  10. ^ A b Geisbert, Thomas W .; Hensley LE; Kagan E; Yu EZ; Geisbert JB; Daddario-DiCaprio K; Fritz EA; Jahrling PB; McClintock K; Phelps JR; Lee AC; Soudce A; Jeffs LB; MacLachlan I (2006). „Postexpoziční ochrana morčat před výzvou smrtelného viru Ebola je dána interferencí RNA“. The Journal of Infectious Diseases. 193 (12): 1650–1657. doi:10.1086/504267. PMC  7110204. PMID  16703508.
  11. ^ Lee, Y-H; Soudce, A D; Seo, D; Kitade, M; Gómez-Quiroz, LE; Ishikawa, T; et al. (2011). „Molekulární cílení na CSN5 v lidském hepatocelulárním karcinomu: mechanismus terapeutické odpovědi“. Onkogen. 30 (40): 4175–4184. doi:10.1038 / dne 2011.126. ISSN  0950-9232. PMC  3140552. PMID  21499307.
  12. ^ Soudce, Adam; Marjorie Robbins; Írán Tavakoli; Jasna Levi; Lina Hu; Anna Fronda; Ellen Ambegia; Kevin McClintock; Ian MacLachian (2009). „Potvrzení mechanismu působení RNAi zprostředkovaného mechanismu působení rakovinných terapeutik na bázi SiRNA u myší“. Journal of Clinical Investigation. 119 (3): 661–673. doi:10.1172 / jci37515. PMC  2648695. PMID  19229107.