Ribosomové profilování - Ribosome profiling

Obrázek ukazuje část zprávy RNA s 5 ribozomy na procesu translace proteinu. Prvním krokem v profilování ribozomu je trávení RNA zprávy ribonukleázovým enzymem, který degraduje veškerou RNA zprávy kromě 5 malých kousků, které jsou chráněny, protože jsou obklopeny ribozomy. Dále jsou proteiny odstraněny z malých kousků RNA a jsou stanoveny základní sekvence malých kousků. Porovnáním těchto sekvencí se sekvencí genu jsou uvedeny přesné polohy ribozomů.
Stručně profilování ribozomu

Ribosomové profilovánínebo Ribo-sekv (také pojmenovaný stopa ribozomu), je adaptací techniky vyvinuté Joan Steitz a Marilyn Kozak před téměř 50 lety Myriam Heiman a Paul Greengard - a samostatně Nicholas Ingolia a Jonathan Weissman - přizpůsobeno pro práci s sekvenování nové generace který používá specializovanou messenger RNA (mRNA ) sekvenování k určení, které mRNA jsou aktivně aktivní přeloženo.[1][2][3]


Vytváří „globální snímek“ všech ribozomy aktivní v buňka v určitém okamžiku, známém jako a translatome. V důsledku toho to umožňuje vědcům identifikovat polohu překlad start stránek, doplněk přeloženého ORF v buňce nebo tkáni distribuce ribozomů na messengerové RNA a rychlost translace ribozomů.[4] Ribosomové profilování zahrnuje podobnou přípravu sekvenční knihovny a analýzu dat jako RNA-sekv, ale na rozdíl od RNA-Seq, která sekvenuje všechny mRNA dané sekvence přítomné ve vzorku, se profilování ribozomu zaměřuje pouze na sekvence mRNA chráněné ribozomem během procesu dekódování translací.[2] Tato technika se liší od polysome profilování.

Dějiny

Profilování ribozomu je založeno na objevu, že mRNA v ribozomu lze izolovat pomocí nukleázy které degradují nechráněné oblasti mRNA. Tato technika analyzuje oblasti mRNA, které se převádějí na protein, a také úrovně translace každé oblasti, aby poskytly přehled o globální genové expresi. Před jeho vývojem byly zahrnuty snahy měřit překlad in vivo microarray analýza na RNA izolované z polysomy, jakož i překladatelské profilování prostřednictvím afinitní čištění epitopu značených ribozomů. Jedná se o užitečné a doplňkové metody, ale ani jeden neumožňuje citlivost a informace o poloze poskytované profilováním ribozomu.[4]

Použití

Existují tři hlavní použití profilování ribozomu: identifikace přeložených oblastí mRNA, sledování toho, jak se rodí peptidy jsou přeloženy a měření množství specifických proteinů, které jsou syntetizovány.

Identifikace přeložených oblastí mRNA

Použitím specifických léků může profilování ribozomu identifikovat buď iniciační oblasti mRNA, nebo elongující oblasti.[5] Iniciující oblasti lze detekovat přidáním harringtoninu nebo laktidomycinu, aby se zabránilo další iniciaci.[5] To umožňuje počáteční kodon mRNA v celé buňce lyzát který má být analyzován, který byl použit k určení non-AUG sekvencí, které iniciují překlad.[2] Další podlouhlé oblasti lze detekovat přidáním antibiotik cykloheximid které inhibují translokaci, chloramfenikol který inhibuje přenos peptidů uvnitř ribozomu, nebo neléčivé prostředky, jako je tepelné zmrazení.[5] Tyto metody prodloužení a zmrazení umožňují analyzovat kinetiku translace. Jelikož více ribozomů může přeložit jednu molekulu mRNA, aby se urychlil proces translace, RiboSeq demonstruje oblasti kódující proteiny v mRNA a jak rychle se to děje v závislosti na sekvenci mRNA.[2][6] To také umožňuje profilování ribozomu k zobrazení pozastavených stránek v rámci přepis u konkrétních kodonů.[6][7] Tato místa pomalé nebo pozastavené translace jsou demonstrována zvýšením hustoty ribozomu a tyto pauzy mohou spojovat specifické proteiny s jejich rolemi v buňce.[2]

Skládání peptidů

Spojení profilování ribozomu s Čip může objasnit, jak a kdy jsou nově syntetizované proteiny složeny.[2] Pomocí stop poskytnutých Ribo-Seq lze vyčistit specifické ribozomy spojené s faktory, jako jsou chaperony. Pozastavení ribozomu ve specifických časových bodech, umožnění jeho translace polypeptidu v čase a vystavení různých bodů chaperonu a vysrážení pomocí ChIP tyto vzorky čistí a může ukázat, ve kterém okamžiku je peptid složen.[2]

Měření syntézy proteinů

Ribo-Seq lze také použít k měření syntézy bílkovin a jejích regulátorů. Toho lze dosáhnout počátečním narušením proteinů, které se vážou na RNA, a použitím ribozomového profilování k měření rozdílu v translaci.[7] Tyto narušené mRNA mohou být asociovány s proteiny, jejichž vazebná místa již byla mapována na RNA, což naznačuje regulaci.[2][7]

Postup

  1. Lýzujte buňky nebo tkáň a izolujte molekuly mRNA navázané na ribozomy.
  2. Imobilizujte komplexy. To se běžně provádí s cykloheximid ale lze použít i jiné chemikálie. Je také možné se vzdát inhibitorů translace s podmínkami nekompetentní lýzy translace.
  3. Pomocí ribonukleáz rozštěpte RNA nechráněnou ribozomy.
  4. Izolujte komplexy mRNA a ribozomu pomocí centrifugace s gradientem hustoty sacharózy nebo specializovaných chromatografických kolon.
  5. Fenol /chloroform čištění směsi k odstranění proteinů.
  6. Výběr velikosti pro dříve chráněné fragmenty mRNA.
  7. Ligujte 3 'adaptér na fragmenty.
  8. Odečtěte známé kontaminující látky rRNA (volitelné).
  9. Reverzní přepis RNA na cDNA použitím reverzní transkriptáza.
  10. Zesilujte způsobem specifickým pro jednotlivé oblasti.
  11. Sekvence čte.
  12. Zarovnejte výsledky sekvence s genomovou sekvencí a určete translační profil.[8]

Materiály

  • RNA-ribozomální komplexy
  • Cykloheximid
  • Nukleázy
  • Fenol / chloroform
  • Reverzní transkriptáza
  • dNTP
  • Sekvenování knihovna metod-cDNA.[8]

Reference

  1. ^ Heiman M, Schaefer A, Gong S, Peterson JD, den M, Ramsey KE; et al. (2008). „Přístup translačního profilování pro molekulární charakterizaci typů buněk CNS“. Buňka. 135 (4): 738–48. doi:10.1016 / j.cell.2008.10.028. PMC  2696821. PMID  19013281.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  2. ^ A b C d E F G h Ingolia NT (březen 2014). "Ribosomové profilování: nové pohledy na překlad, od jednotlivých kodonů po genomové měřítko". Recenze přírody. Genetika. 15 (3): 205–13. doi:10.1038 / nrg3645. PMID  24468696.
  3. ^ Dougherty, Joseph D. (13. prosince 2017). „Rozšiřující se sada nástrojů pro překládání afinity k ribozomu“. Journal of Neuroscience. 37 (50): 12079–12087. doi:10.1523 / JNEUROSCI.1929-17.2017. Citováno 2020-11-16.
  4. ^ A b Weiss RB, Atkins JF (prosinec 2011). „Molekulární biologie. Překlad jde globálně“. Věda. 334 (6062): 1509–10. doi:10.1126 / science.1216974. PMID  22174241.
  5. ^ A b C Michel AM, Baranov PV (září 2013). „Ribosomové profilování: Hi-Def monitor pro syntézu proteinů v širokém měřítku“. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5): 473–90. doi:10,1002 / wrna.1172. PMC  3823065. PMID  23696005.
  6. ^ A b Buskirk AR, Green R (březen 2017). „Ribozom pozastavuje, zatýká a zachraňuje bakterie a eukaryoty“. Filozofické transakce Královské společnosti v Londýně. Série B, Biologické vědy. 372 (1716): 20160183. doi:10.1098 / rstb.2016.0183. PMC  5311927. PMID  28138069.
  7. ^ A b C Andreev DE, O'Connor PB, Loughran G, Dmitriev SE, Baranov PV, Shatsky IN (leden 2017). „Pohledy na mechanismy eukaryotického překladu získané profilováním ribozomu“. Výzkum nukleových kyselin. 45 (2): 513–526. doi:10.1093 / nar / gkw1190. PMC  5314775. PMID  27923997.
  8. ^ A b Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, Weissman JS (duben 2009). „Analýza v celém genomu translace in vivo s rozlišením nukleotidů pomocí profilování ribozomu“. Věda. 324 (5924): 218–23. doi:10.1126 / science.1168978. PMC  2746483. PMID  19213877.

externí odkazy