Radioimunoprecipitační testovací pufr - Radioimmunoprecipitation assay buffer

Radioimunoprecipitační testovací pufr (RIPA buffer) je a lyzační pufr bývalo lyžovat buňky a tkáně pro rádio imunoprecipitace test (RIPA).^[1][2] Tato vyrovnávací paměť je více denaturující než NP-40 nebo Triton X-100 protože obsahuje iontové detergenty SDS a deoxycholát sodný jako aktivní složky a je zvláště užitečný pro narušení jaderných membrán při přípravě jaderných extraktů. Vyrovnávací paměť RIPA poskytuje nízké pozadí, ale může denaturovat kinázy.

Recept

Recepty vyrovnávací paměti RIPA se mezi autory mírně liší a mohou zahrnovat:

• 10-50 mM Tris -HCl (10 mM fosforečnan sodný místo toho lze použít), pH 7–8
• 150 mM NaCl k udržení osmotického tlaku téměř fyziologického
• neiontové detergenty (1% Triton X-100 nebo NP-40 ), aby se zabránilo nespecifickým interakcím mezi proteiny nebo se zkumavkou
• aniontové prací prostředky (0,1-0,5% deoxycholát, 0.1-0.5% BL ). To je třeba optimalizovat pro každý test, čím vyšší je koncentrace, tím čistší je výsledek, ale tím nižší je signál.

Následující přísady jsou volitelné a jsou zahrnuty podle potřeby:

• Proteáza inhibitory (1 mM PMSF (čerstvé z 1 M zásobního roztoku v i-propanolu), každý po 1 ug / ml leupeptin, aprotinin, pepstatin, 1-5 mM EDTA 0,5-1 mM EGTA, 5 mM kyselina aminokapronová ) nebo komerční koktejl s inhibitorem proteázy (použití podle pokynů výrobce)
• 1 mM každý Na₃VO₄ a Na₄P₂Ó₇ jako inhibitor fosfatázy (pokud je důležitý stav fosforylace)
• 1 mM NaF jako konzervační prostředek (velmi toxický!)
• 5-10 mM dithiothreitol (DTT) nebo β-merkaptoethanol jako antioxidant. DTT je dražší než βME, ale jeho redoxní potenciál je vhodnější pro vazbu Cys-Cys.

Reference

Tento biologie článek je a pahýl. Wikipedii můžete pomoci pomocí rozšiřovat to.