Krystalizace bílkovin - Protein crystallization

Krystaly bílkovin pěstovaných na NÁS. Raketoplán nebo ruština Vesmírná stanice, Mir.

Krystalizace bílkovin je proces formování pravidelného pole jednotlivých proteinových molekul stabilizovaných krystalovými kontakty. Pokud je krystal dostatečně uspořádaný, bude difrakce. Některé proteiny přirozeně tvoří krystalická pole aquaporin v oční čočce.[1]

V procesu krystalizace proteinu jsou proteiny rozpuštěny ve vodném prostředí a v roztoku vzorku, dokud nedosáhnou přesycený stav.[2] K dosažení tohoto stavu se používají různé metody, jako je difúze par, mikrobatch, mikrodialýza a difúze na volném rozhraní. Vývoj proteinových krystalů je obtížný proces ovlivněný mnoha faktory, včetně pH, teploty, iontové síly v krystalizačním roztoku a dokonce i gravitace.[2] Jakmile se tyto krystaly vytvoří, lze je použít strukturní biologie ke studiu molekulární struktury proteinu, zejména pro různé průmyslové nebo lékařské účely.[3][4]

Vývoj krystalizace bílkovin

Vědci již více než 150 let vědí o krystalizaci molekul bílkovin.[5]

Hemoglobin SC Krystaly pozorované mikroskopem.

V roce 1840 Friedrich Ludwig Hünefeld náhodně objevil tvorbu krystalického materiálu ve vzorcích krve žížaly držených pod dvěma skleněnými sklíčky a příležitostně pozoroval malé deskovité krystaly ve vyschlých prasečích nebo lidských vzorcích krve. Tyto krystaly byly pojmenovány jako „hemoglobin“ Felixem Hoppe-Seylerem v roce 1864. Klíčové nálezy Hünefelda inspirovaly v budoucnosti mnoho vědců.[6]

V roce 1851 popsal Otto Funke proces výroby krystalů lidského hemoglobinu zředěním červených krvinek rozpouštědly, jako je čistá voda, alkohol nebo ether, následovaným pomalým odpařováním rozpouštědla z proteinového roztoku. V roce 1871 vydal William T. Preyer, profesor na univerzitě v Jeně, knihu s názvem Die Blutkrystalle (The Crystals of Blood), zkoumání vlastností krystalů hemoglobinu od přibližně 50 druhů savců, ptáků, plazů a ryb.[6]

V roce 1909 vydal fyziolog Edward T. Reichert společně s mineralogem Amosem P. Brownem pojednání o přípravě, fyziologii a geometrické charakterizaci krystalů hemoglobinu od několika stovek zvířat, včetně vyhynulých druhů, jako je tasmánský vlk.[6] Byly nalezeny zvyšující se proteinové krystaly.

V roce 1934 John Desmond Bernal a jeho student Dorothy Hodgkin objevili, že proteinové krystaly obklopené jejich matečným louhem poskytly lepší difrakční obrazce než sušené krystaly. Použitím pepsin, byli první, kdo rozeznal difrakční obraz vlhkého globulárního proteinu. Před Bernalem a Hodgkinem byla proteinová krystalografie prováděna pouze za sucha s nekonzistentními a nespolehlivými výsledky. Toto je první rentgenový difrakční obrazec proteinového krystalu.[7]

V roce 1958 byla struktura myoglobinu (červený protein obsahující hem), určená rentgenovou krystalografií, poprvé uvedena John Kendrew.[8] Kendrew sdílel 1962 Nobelova cena za chemii s Max Perutz pro tento objev.[3]

Nyní, na základě proteinových krystalů, jejich struktury hrají významnou roli v biochemii a translační medicíně.

Základy krystalizace bílkovin

Lyzozym krystaly pozorované přes polarizační filtr.

Teorie krystalizace proteinů

Podstatou tvorby krystalů je umožnění roztoku vzorku dosáhnout přesyceného stavu.[2] Přesycení je definováno v McPherson et al. 2014 jako „nerovnovážný stav, při kterém je v roztoku přítomno určité množství makromolekuly přesahující mez rozpustnosti za specifických chemických a fyzikálních podmínek.“[2] Tvorba pevných látek v roztoku, jako je agregace a krystaly, podporuje opětovné nastolení rovnováhy. Systém chce obnovit rovnováhu, takže každá složka ve energetickém vyjádření je na minimu.[2] Energetické vyjádření zahrnuje tři hlavní faktory, kterými jsou entalpie (∆H), entropie (∆S) a teplota (T).[9] ∆H v tomto výrazu souvisí s ∆H chemických vazeb, které se vytvářejí a rozbíjejí při reakcích nebo fázových změnách.[9] ∆S se týká stupně volnosti nebo měření nejistoty, které mohou molekuly mít.[9] Spontánnost procesu, Gibbova volná energie (∆G), je definována jako ∆G = ∆H-T∆S.[9] Z tohoto důvodu buď zvýšení ∆S, nebo snížení ∆H přispívá k spontánnosti celkového procesu, čímž se negativeG stává negativnějším, čímž se dosáhne minimálního energetického stavu systému.[9] Když se vytvoří krystaly, proteinové molekuly se stanou více uspořádanými, což vede ke snížení ∆S a zvýšení ∆G pozitivnějšího.[10] Spontánní krystalizace proto vyžaduje dostatečně negativní ∆H k překonání ztráty entropie z více uspořádaného systému.[10]

Molekulární pohled od řešení ke krystalu

Tvorba krystalů vyžaduje dva kroky: nukleaci a růst.[2] Nukleace je iniciačním krokem pro krystalizaci.[2] Ve fázi nukleace se proteinové molekuly v roztoku spojují jako agregáty a vytvářejí stabilní pevné jádro.[2] Jak se tvoří jádro, krystal se zvětšuje a zvětšuje molekulami navázanými na toto stabilní jádro.[2] Krok nukleace je kritický pro tvorbu krystalů, protože se jedná o fázový přechod prvního řádu vzorků, které přecházejí z vysokého stupně volnosti do získání uspořádaného stavu (vodného na pevný).[2] Aby byl nukleační krok úspěšný, je nezbytná manipulace s parametry krystalizace. Přístupem ke krystalizaci proteinu je dosažení nižší rozpustnosti cílového proteinu v roztoku.[2] Jakmile je překročena mez rozpustnosti a jsou přítomny krystaly, je dosaženo krystalizace.[2]

Metody krystalizace proteinů

Difúze par

Tři způsoby přípravy krystalů, A: Závěsná kapka. B: Sedící kapka. C: Mikrodialýza

Difúze par je nejčastěji používanou metodou krystalizace proteinu. V této metodě jsou kapičky obsahující vyčištěný protein, pufr a srážecí prostředek povoleny ekvilibrovat s větším rezervoárem obsahujícím podobné pufry a srážedla ve vyšších koncentracích. Zpočátku kapička proteinového roztoku obsahuje poměrně nízké koncentrace precipitátu a proteinu, ale jak se kapka a rezervoár vyrovnávají, koncentrace precipitátu a proteinu se v kapce zvyšují. Pokud se pro daný protein použijí vhodné krystalizační roztoky, dojde k růstu krystalů v kapce.[11][12] Tato metoda se používá, protože umožňuje jemné a postupné změny v koncentraci bílkovin a srážení, které napomáhají růstu velkých a dobře uspořádaných krystalů.

Difúzi par lze provádět buď ve formátu visícího, nebo sedícího typu. Zařízení se zavěšenou kapkou zahrnuje kapku proteinového roztoku umístěnou na obrácený krycí sklíčko, které je poté zavěšeno nad zásobníkem. Přístroj pro krystalizaci sedací kapky umístí kapku na podstavec, který je oddělen od zásobníku. Obě tyto metody vyžadují utěsnění prostředí, aby mohlo dojít k rovnováze mezi kapkou a zásobníkem.[11][13]

Mikrobatch

Mikrošarže obvykle zahrnuje ponoření velmi malého objemu kapiček proteinu do oleje (pouhých 1 µl). Důvod, proč je olej potřebný, je ten, že se používá tak malý objem proteinového roztoku, a proto musí být zastaveno odpařování, aby se experiment provedl přesně. I když lze použít různé oleje, dvěma nejběžnějšími těsnicími prostředky jsou parafínové oleje (popsané Chayen et al.) A silikonové oleje (popsané D’Arcy). Existují také další metody pro mikrobarování, které nepoužívají kapalné těsnicí prostředky a místo toho vyžadují, aby vědec po umístění kapky do jamky rychle umístil film nebo nějakou pásku na svařenou desku.

Kromě velmi omezeného množství potřebného vzorku má tato metoda také další výhodu v tom, že vzorky jsou chráněny před kontaminací vzduchem, protože během experimentu nejsou nikdy vystaveny působení vzduchu.

Mikrodialýza

Mikrodialýza využívá semipermeabilní membránu, přes kterou mohou procházet malé molekuly a ionty, zatímco proteiny a velké polymery nemohou procházet. Vytvořením gradientu koncentrace rozpuštěné látky přes membránu a umožněním systému postupovat směrem k rovnováze se systém může pomalu pohybovat směrem k přesycení, kdy se mohou tvořit proteinové krystaly.

Mikrodialýza může produkovat krystaly solením, za použití vysokých koncentrací soli nebo jiných malých pro membránu propustných sloučenin, které snižují rozpustnost proteinu. Velmi občas mohou některé proteiny krystalizovat solením dialýzou, dialýzou proti čisté vodě, odstraněním rozpuštěných látek, podněcováním k asociaci a krystalizací.

Difúze bez rozhraní

Tato technika spojuje proteinové a srážecí roztoky, aniž by je předem namíchala, ale místo toho je injektovala oběma stranami kanálu a umožnila tak rovnováhu difúzí. Oba roztoky přicházejí do kontaktu v komoře reagentu, oba v jejich maximálních koncentracích, a vyvolávají tak spontánní nukleaci. Jak systém přichází do rovnováhy, úroveň přesycení klesá, což podporuje růst krystalů.[14]

Faktory ovlivňující krystalizaci proteinů

pH

Základní hnací silou pro krystalizaci proteinu je optimalizovat počet vazeb, které lze vytvořit s jiným proteinem prostřednictvím intermolekulárních interakcí.[2] Tyto interakce závisí na hustotách elektronů molekul a proteinových postranních řetězcích, které se mění v závislosti na pH.[9] Terciární a kvartérní struktura proteinů je určena intermolekulárními interakcemi mezi postranními skupinami aminokyselin, ve kterých jsou hydrofilní skupiny obvykle obráceny směrem ven k roztoku a vytvářejí tak hydratační obal pro rozpouštědlo (vodu).[9] Jak se mění pH, mění se náboj na této polární straně také s ohledem na pH roztoku a pKa proteinu. Volba pH je tedy zásadní buď pro podporu tvorby krystalů, kde je vzájemná vazba mezi molekulami příznivější než u molekul vody.[9] pH je jednou z nejsilnějších manipulací, které lze přiřadit pro optimální podmínky krystalizace.

Teplota

Teplota je dalším zajímavým parametrem k diskusi, protože rozpustnost bílkovin je funkcí teploty.[15] V krystalizaci bílkovin je manipulace s teplotou za získání úspěšných krystalů jednou běžnou strategií. Na rozdíl od pH může teplota různých složek krystalografických experimentů ovlivnit konečné výsledky, jako je teplota přípravy pufru,[16] teplota skutečného krystalizačního experimentu atd.

Chemické přísady

Chemické přísady jsou malé chemické sloučeniny, které se přidávají do procesu krystalizace ke zvýšení výtěžku krystalů.[17] Role malých molekul v krystalizaci proteinů nebyla v prvních dnech dobře promyšlena, protože ve většině případů byly považovány za kontaminanty.[17] Menší molekuly krystalizují lépe než makromolekuly, jako jsou proteiny, proto bylo použití chemických přísad před studií McPhersonem omezeno. Jedná se však o silný aspekt experimentálních parametrů pro krystalizaci, který je důležitý pro další zkoumání a použití biochemiky a krystalografy.[17]

Technologie napomáhající krystalizaci proteinů

Vysoce výkonný krystalizační screening [18]

Existují metody vysoké propustnosti, které pomáhají zefektivnit velké množství experimentů potřebných k prozkoumání různých podmínek, které jsou nezbytné pro úspěšný růst krystalů. Na objednávku je k dispozici řada reklamních souprav, které aplikují předem sestavené přísady v systémech zaručujících úspěšnou krystalizaci. Použitím takové sady se vědec vyhne potížím s čištěním proteinu a stanovením vhodných krystalizačních podmínek.

Manipulace s kapalinami roboti lze použít k nastavení a automatizaci velkého počtu krystalizačních experimentů současně. To, co by jinak byl pomalý a potenciálně náchylný k chybám, proces prováděný člověkem, lze účinně a přesně dosáhnout automatizovaným systémem. Systémy robotické krystalizace používají stejné komponenty popsané výše, ale provádějí každý krok postupu rychle as velkým počtem replikátů. Každý experiment využívá malá množství roztoku a výhoda menší velikosti je dvojnásobná: menší velikosti vzorku snižují nejen výdaje na vyčištěný protein, ale menší množství roztoku vede k rychlejší krystalizaci. Každý experiment je monitorován kamerou, která detekuje růst krystalů.[12]

Proteinové inženýrství

Proteiny mohou být navrženy tak, aby zlepšily šanci na úspěšnou krystalizaci proteinu pomocí technik, jako je redukce povrchové entropie[19] nebo inženýrství v krystalových kontaktech.[20] Často problematické cystein zbytky lze nahradit alaninem, aby se zabránilo disulfid zprostředkovaná agregace a zbytky, jako je lysin, glutamát a glutamin, lze změnit na alanin, aby se snížila vnitřní flexibilita proteinu, což může bránit krystalizaci.

Aplikace proteinové krystalografie

Makromolekulární struktury lze stanovit z proteinového krystalu pomocí různých metod, včetně Rentgenová difrakce /Rentgenová krystalografie, Kryogenní elektronová mikroskopie (CryoEM) (počítaje v to Elektronová krystalografie a Mikrokrystalická elektronová difrakce (MicroED) ), Malý úhel rentgenového rozptylu, a Neutronová difrakce. Viz také Strukturní biologie.

Krystalizace proteinů může být také užitečná při formulaci proteinů pro farmaceutické účely.[21]

Viz také

Reference

  1. ^ Schey, Kevin L .; Wang, Zhen; L. Wenke, Jamie; Qi, Ying (květen 2014). „Aquaporiny v oku: výraz, funkce a role při očních onemocněních“. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Obecné předměty. 1840 (5): 1513–1523. doi:10.1016 / j.bbagen.2013.10.037. PMC  4572841. PMID  24184915.
  2. ^ A b C d E F G h i j k l m McPherson, Alexander; Gavira, Jose A. (2013-12-24). "Úvod do krystalizace bílkovin". Acta Crystallographica oddíl F. 70 (1): 2–20. doi:10,1107 / s2053230x13033141. ISSN  2053-230X. PMC  3943105. PMID  24419610.
  3. ^ A b Blundell, Tom L. (2017-06-29). „Proteinová krystalografie a objev drog: vzpomínky na výměnu znalostí mezi akademickou obcí a průmyslem“. IUCrJ. 4 (4): 308–321. doi:10.1107 / s2052252517009241. ISSN  2052-2525. PMC  5571795. PMID  28875019.
  4. ^ Tripathy, Debu; Bardia, Aditya; Sellers, William R. (2017-03-28). „Ribociclib (LEE011): Mechanismus účinku a klinický dopad tohoto selektivního inhibitoru kinázy 4/6 závislé na cyklinu v různých pevných nádorech“. Klinický výzkum rakoviny. 23 (13): 3251–3262. doi:10.1158 / 1078-0432.ccr-16-3157. ISSN  1078-0432. PMC  5727901. PMID  28351928.
  5. ^ McPherson, Alexander (březen 1991). "Stručná historie růstu proteinových krystalů". Journal of Crystal Growth. 110 (1–2): 1–10. Bibcode:1991JCrGr.110 .... 1M. doi:10.1016/0022-0248(91)90859-4. ISSN  0022-0248.
  6. ^ A b C Giegé, Richard (prosinec 2013). "Historický pohled na krystalizaci proteinů od roku 1840 do současnosti". FEBS Journal. 280 (24): 6456–6497. doi:10.1111 / febs.12580. ISSN  1742-4658. PMID  24165393.
  7. ^ Tulinsky, A. (1996), Kapitola 35. Projekt Protein Structure, 1950–1959: První soustředěné úsilí o stanovení struktury proteinů v USAVýroční zprávy z lékařské chemie 31, Elsevier, s. 357–366, doi:10.1016 / s0065-7743 (08) 60474-1, ISBN  9780120405312
  8. ^ KENDREW, J. C .; BODO, G .; DINTZIS, H. M .; PARRISH, R. G .; WYCKOFF, H .; PHILLIPS, D. C. (březen 1958). „Trojrozměrný model molekuly myoglobinu získaný rentgenovou analýzou“. Příroda. 181 (4610): 662–666. Bibcode:1958Natur.181..662K. doi:10.1038 / 181662a0. ISSN  0028-0836. PMID  13517261.
  9. ^ A b C d E F G h Boyle, John (leden 2005). „Lehninger principy biochemie (4. vydání): Nelson, D. a Cox, M.“. Výuka biochemie a molekulární biologie. 33 (1): 74–75. doi:10.1002 / bmb.2005.494033010419. ISSN  1470-8175.
  10. ^ A b McPHERSON, Alexander (duben 1990). "Současné přístupy k makromolekulární krystalizaci". European Journal of Biochemistry. 189 (1): 1–23. doi:10.1111 / j.1432-1033.1990.tb15454.x. ISSN  0014-2956. PMID  2185018.
  11. ^ A b Rhodes, G. (2006) Crystallography Made Crystal Clear, třetí vydání: Průvodce pro uživatele makromolekulárních modelů, 3. vydání, Academic Press
  12. ^ A b „Křišťálový robot“. Prosinec 2000. Citováno 2003-02-18.
  13. ^ McRee, D (1993). Praktická krystalografie proteinů. San Diego: Academic Press. s. 1–23. ISBN  978-0-12-486052-0.
  14. ^ Rupp, Bernhard (20. října 2009). Biomolekulární krystalografie: principy, praxe a aplikace na strukturní biologii. Věnec věnec. p. 800. ISBN  9781134064199. Citováno 28. prosince 2016.
  15. ^ Pelegrine, D.H.G .; Gasparetto, C.A. (Únor 2005). "Rozpustnost syrovátkových proteinů jako funkce teploty a pH". LWT - potravinářská věda a technologie. 38 (1): 77–80. doi:10.1016 / j.lwt.2004.03.013. ISSN  0023-6438.
  16. ^ Chen, Rui-Qing; Lu, Qin-Qin; Cheng, Qing-Di; Ao, Liang-Bo; Zhang, Chen-Yan; Hou, Hai; Liu, Yong-Ming; Li, Da-Wei; Yin, Da-Chuan (2015-01-19). „Ignorovaná proměnná: teplota přípravy roztoku při krystalizaci proteinu“. Vědecké zprávy. 5 (1): 7797. Bibcode:2015NatSR ... 5E7797C. doi:10.1038 / srep07797. ISSN  2045-2322. PMC  4297974. PMID  25597864.
  17. ^ A b C McPherson, Alexander; Cudney, Bob (prosinec 2006). „Hledání stříbrných střel: Alternativní strategie pro krystalizaci makromolekul“ (PDF). Journal of Structural Biology. 156 (3): 387–406. doi:10.1016 / j.jsb.2006.09.006. ISSN  1047-8477. PMID  17101277.
  18. ^ Lin, Yibin (20. dubna 2018). „Co se stalo za posledních pět let s vysoce výkonným screeningem proteinové krystalizace?“. Odborné stanovisko k objevu drog. 13 (8): 691–695. doi:10.1080/17460441.2018.1465924. PMID  29676184.
  19. ^ Cooper, David R .; Boczek, Tomasz; Grelewska, Katarzyna; Pinkowska, Malgorzata; Sikorska, Malgorzata; Zawadzki, Michal; Derewenda, Zygmunt (01.05.2007). „Krystalizace bílkovin redukcí povrchové entropie: optimalizace strategie SER“. Acta Crystallographica Oddíl D Biologická krystalografie. 63 (5): 636–645. doi:10.1107 / S0907444907010931. ISSN  0907-4449. PMID  17452789.
  20. ^ Gonen, S .; DiMaio, F .; Gonen, T .; Baker, D. (2015-06-19). „Návrh uspořádaných dvourozměrných polí zprostředkovaných nekovalentními rozhraními protein-protein“. Věda. 348 (6241): 1365–1368. Bibcode:2015Sci ... 348.1365G. doi:10.1126 / science.aaa9897. ISSN  0036-8075. PMID  26089516.
  21. ^ Jen, A. a Merkle, H. P. (2001) Diamonds in the Rough: Protein Crystals from a Formulation Perspective Pharm Res 18, 1483–1488

externí odkazy