Nestabilita mikrosatelitu - Microsatellite instability

Mikrograf zobrazeno lymfocyty infiltrující nádor v případě kolorektální karcinom s důkazem o MSI-H na imunobarvení. H&E skvrna.

Nestabilita mikrosatelitu (MSI) je podmínkou genetický hypermutovatelnost (predispozice k mutace ), který je výsledkem poškození Oprava nesouladu DNA (MMR). Přítomnost MSI představuje fenotypový důkaz, že MMR nefunguje normálně.

MMR opravuje chyby, které se spontánně vyskytnou během replikace DNA, například neshody jedné základny nebo krátké vložení a vypuštění. Proteiny zapojené do MMR jsou správné polymeráza chyby vytvořením komplexu, který se váže na neodpovídající část DNA, chybu vyřízne a na její místo vloží správnou sekvenci.^[1] Buňky s abnormálně fungujícím MMR nejsou schopny opravit chyby, které se vyskytnou během replikace DNA, a následně hromadit chyby. To způsobí vznik románu mikrosatelit fragmenty. Polymerázová řetězová reakce testy mohou odhalit tento román mikrosatelity a poskytnout důkazy o přítomnosti MSI.

Mikrosatelity jsou opakované sekvence DNA. Tyto sekvence mohou být vytvořeny z opakujících se jednotek od jedné do šesti základní páry v délce. Ačkoli je délka těchto mikrosatelitů velmi různá od člověka k člověku a přispívá k „otisku prstu“ DNA, každý jedinec má mikrosatelity stanovené délky. Nejběžnějším mikrosatelitem u lidí je dinukleotidová repetice nukleotidy C a A, který se vyskytuje desítky tisíckrát napříč genomem. Mikrosatelity jsou také známé jako opakování jednoduchých sekvencí (SSR).

Příklad nestability mikrosatelitu ve stopě elektroferogramu DNA

Struktura

Struktura mikrosatelitové nestability se skládá z opakovaných nukleotidů, nejčastěji viditelných jako opakování GT / CA.^[2]

Výzkumníci ještě musí potvrdit přesnou definici struktury MSI. Zatímco se všichni vědci shodují na tom, že mikrosatelity jsou opakované sekvence, délky sekvencí zůstávají v otázce. Některé výzkumy naznačují, že MSI jsou krátké tandemové DNA opakující se sekvence jednoho až šesti párů bází v celém genomu, zatímco jiné výzkumy naznačují, že rozsah může být dva až pět.^[3]

Ačkoli se vědci neshodují na konkrétní prahové hodnotě pro počet tandemových opakování, které tvoří mikrosatelit, existuje shoda ohledně jejich relativní velikosti. Jsou volány delší sekvence minisatelit a jsou volány i delší sekvence satelitní DNA stránky. Někteří vědci rozlišují mezi třemi kategoriemi podle minimálního počtu párů bází a jiní používají minimální počet opakovaných jednotek. Většina opakování se vyskytuje v nepřekládaných oblastech, konkrétně introny. Mikrosatelity, které se vyskytují v kódujících oblastech, však často inhibují expanzi většiny následných událostí. Mikrosatelity tvoří přibližně tři procenta lidského genomu nebo více než milion fragmentů DNA. Hustota mikrosatelitu se zvyšuje s velikostí genomu a je vidět dvakrát tolik na koncích ramen chromozomu než v tělech chromozomu.^[4]

Forma a funkce

MSI byla objevena v 70. a 80. letech. První lidské onemocnění připisované MSI bylo xeroderma pigmentosum. Toto onemocnění bylo důsledkem dvou alel aktivujících mutace při opravě nukleotidové excize.

V širším smyslu je MSI výsledkem neschopnosti proteinů MMM (Mismatch Repair) opravit chybu replikace DNA. K replikaci DNA dochází ve fázi „S“ DNA buněčný cyklus; vadná událost vytvářející oblast MSI nastane během druhé události replikace. Původní řetězec je nezraněný, ale u dceřiného řetězce dochází k mutaci rámcového posunu v důsledku prokluzu DNA polymerázy. Konkrétně DNA polymeráza klouže a vytváří dočasnou smyčku inzerce-delece, kterou obvykle rozpoznávají proteiny MMR. Pokud však proteiny MMR nefungují normálně, jako v případě MSI, vede tato smyčka k mutacím s posunem rámce, buď prostřednictvím inzercí nebo delecí, čímž se získají nefunkční proteiny.^[5]

MSI je jedinečný pro polymorfismy DNA v tom, že chyby replikace se liší délkou místo sekvence. Rychlost a směr mutací poskytujících MSI jsou hlavními složkami při určování genetických rozdílů. Vědci se dodnes shodují na tom, že mutační rychlosti se liší v poloze loci. Čím větší je délka MSI, tím větší je rychlost mutace.^[4]

Ačkoli většina mutací MSI je výsledkem mutací rámcového posunu, příležitostně jsou mutační události vedoucí k MSI odvozeny z hypermethylace promotoru hMLH1 (protein MMR). Hypermethylace nastává, když je k DNA nukleotidu přidána methylová skupina, což vede k umlčení genu, čímž se získá MSI.^[6]

Vědci prokázali, že oxidační poškození vede k mutacím rámcového posunu, čímž se získá MSI, ale musí se ještě dohodnout na přesném mechanismu. Ukázalo se, že čím více je na systém kladen oxidační stres, tím je pravděpodobnější, že dojde k mutacím. Kataláza navíc snižuje mutace, zatímco měď a nikl zvyšují mutace zvýšením redukce peroxidů. Někteří vědci se domnívají, že oxidační stres na konkrétních lokusech vede k pozastavení DNA polymerázy na těchto místech a vytvoření prostředí pro prokluz DNA.^[7]

Vědci nejprve věřili, že MSI je náhodná, ale existují důkazy, které naznačují, že cíle MSI zahrnují rostoucí seznam genů. Mezi příklady patří Beta receptor transformujícího růstového faktoru gen a BAX gen. Každý cíl vede k různým fenotypům a patologiím.^[8]

Klinický význam

Nestabilita mikrosatelitů je spojena s rakovinou tlustého střeva, rakoviny žaludku, rakoviny endometria, rakoviny vaječníků, rakoviny hepatobiliárního traktu, rakoviny močových cest, rakoviny mozku a rakoviny kůže. MSI je nejčastější v asociacích s rakovinou tlustého střeva. Každý rok je na celém světě více než 500 000 případů rakoviny tlustého střeva. Na základě nálezů od více než 7 000 pacientů stratifikovaných pro MSI-High (MSI-H), MSI-Low (MSI-L) nebo Microsatellite Stable (MSS) rakoviny tlustého střeva měli pacienti s MSI-H nádory pozitivnější prognózu o 15% ve srovnání s nádory MSI-L nebo MSS.^[9]

Kolorektální nádory s MSI se nalézají v pravém tlustém střevě, spojené se špatnou diferencovanou tkání, vysokými mucinogeny, nádory infiltrujícími lymfocyty a přítomností Crohnovy reakce hostitele. Nádory MSI-H přispívající ke kolorektálnímu karcinomu vykazují méně metastáz než jiné odvozené kolorektální karcinomy. To dokazuje předchozí výzkum, který ukazuje, že nádory MSI-H jsou reprezentativnější ve stádiu II než ve stádiu III.^[3]

Vědci zkoumali souvislost vakuolární třídění proteinů (VPS) proteiny na MSI. Stejně jako MSI je VPS spojen s rakovinou žaludku a tlustého střeva. Jedna studie uvádí, že proteiny VPS byly spojeny s rakovinou MSI-H, ale nikoli s rakovinou MSI-L, což omezuje VPS na rakoviny specifické pro MSI-H.^[10]

Vědci se dále shodují, že stav MSI-H indikuje diagnózu Lynchův syndrom, nemetastatická prognóza a méně agresivní léčebné režimy. Lynchův syndrom je spojován s MSI a zvyšuje riziko vzniku rakoviny tlustého střeva, endometria, vaječníků, žaludku, tenkého střeva, hepatobiliárních cest, močových cest, mozku a kůže.^[3]

Jedna studie provedla více než 120 pacientů s Lynchovým syndromem a přisuzovala Crohnovu reakci (CLR) spojenou s MSI „nádorově specifické neopeptidy generované během MSI-H karcinogeneze“. Tato studie dále potvrdila, že „přítomnost antimetastatické imunitní ochrany u pacientů s MSI-H CRC může vysvětlit nedávná zjištění, že adjuvantní chemoterapie 5-FU nemá v tomto kolektivu žádné příznivé nebo dokonce nepříznivé účinky“. Vědci předpokládají, že existuje ochranná role lymfocytů proti MSI-H CRC, která zabraňuje metastázám v nádoru.^[11]

MSI nádory u 15% sporadického kolorektálního karcinomu jsou výsledkem hypermethylace promotoru genu MLH 1, zatímco nádory MSI u Lynchova syndromu jsou způsobeny zárodečnými mutacemi v MLH 1, MSH 2, MSH 6 a PMS2.^[3]

MSI je evidentní v příčině mazových karcinomů. Mastné karcinomy jsou podmnožinou větší patologie, Muir-Torreův syndrom. MSI je variabilně exprimován v Muir-Torreově syndromu, nejčastěji u společných patologických stavů u pacientů s rakovinou tlustého střeva. Dále jsou MMR proteiny MLH 1, MSH 2, MSH6 a PMS2 instrumentální v periokulárním mazovém karcinomu, který je na víčku vidět u 40% mazových karcinomů.^[12]

V květnu 2017 FDA schválila imunoterapii nazvanou Keytruda® (pembrolizumab ) (PD-1 inhibitor ) u pacientů s neresekovatelnými nebo metastatickými mikrosatelitními nestabilitami - vysokými (MSI-H) nebo solidními tumory s nedostatečnou opravou (dMMR), u kterých došlo k progresi po předchozí léčbě. Tato indikace je nezávislá na PD-L1 hodnocení exprese, typ tkáně a umístění nádoru.^[13]

Diagnostika nestability mikrosatelitů

MSI je dobrým markerem pro stanovení Lynchova syndromu a pro stanovení prognózy léčby rakoviny. V roce 1996 uspořádal National Cancer Institute (NCI) mezinárodní workshop o Lynchově syndromu, který vedl k vývoji „Bethesda Guidelines“ a lokusů pro testování MSI. Během tohoto prvního semináře se NCI dohodlo na pěti mikrosatelitních markerech nezbytných k určení přítomnosti MSI: dva mononukleotidy, BAT25 a BAT26 a tři dinukleotidové repetice, D2S123, D5S346 a D17S250. Nádory MSI-H jsou výsledkem MSI více než 30% nestabilních lokusů MSI (> 2 nebo více z 5 lokusů). Nádory MSI-L jsou výsledkem méně než 30% nestabilních biomarkerů MSI. Nádory MSI-L jsou klasifikovány jako nádory alternativní etiologie. Několik studií ukazuje, že pacienti s MSI-H nejlépe reagují na samotný chirurgický zákrok, spíše než na chemoterapii a chirurgický zákrok, čímž zabraňují pacientům zbytečně podstupovat chemoterapii.^[3]

Detekce nestability mikrosatelitů pomocí PCR v reálném čase

O šest let později, během druhého semináře pořádaného NCI k revizi Lynchova syndromu v roce 2002, byly revidovány pokyny Bethesda (později publikovány v roce 2004^[14]), který doporučil nová kritéria pro testování MSI. Konkrétně identifikovali pět mononukleotidových lokusů jako lepší než směs mono a dinukleotidových lokusů, protože dinukleotidové lokusy se mohly jevit posunuté, i když ve skutečnosti nebyly, čímž se zvýšila možnost falešně pozitivního výsledku MSI-H.

První komerčně dostupnou sadu poskytl Promega Corporation, Madison, Wisconsin volal Systém analýzy mikrosatelitové nestability 1.2 (RUO). Od té doby je Promega MSI RUO široce přijímán od roku 2004 a více než 120 recenzovaných publikací uvádí jeho globální postavení jako zlatý standard při určování stavu MSI rakovinné tkáně.

Nedávno byly detekční soupravy MSI pro detekci MSI v reálném čase [1] byly úspěšně uvedeny na trh. Za kritické výhody byl považován jednokrokový uzavřený formát, vysoká přesnost a citlivost produktů založených na PCR v reálném čase bez jakékoli další analýzy po amplifikaci PCR ve srovnání s tradičními metodami (PCR s následnou fragmentární analýzou).

Přímé a nepřímé mechanismy přispívají k rezistenci na chemoterapii. Přímé mechanismy zahrnují cesty, které metabolizují léčivo, zatímco nepřímé mechanismy zahrnují cesty, které reagují na chemoterapii. Cesta opravy NER DNA hraje podstatnou roli při zvrácení poškození buněk způsobeného chemoterapeutiky, jako je 5-FU.^[15]

Objevy od roku 2010

V květnu 2017 FDA schválila imunoterapii nazvanou Keytruda® (pembrolizumab ) (PD-1 inhibitor ) u pacientů s neresekovatelnými nebo metastatickými mikrosatelitními nestabilitami - vysokými (MSI-H) nebo solidními tumory s nedostatečnou opravou (dMMR), u kterých došlo k progresi po předchozí léčbě. Tato indikace je nezávislá na PD-L1 hodnocení exprese, typ tkáně a umístění nádoru.^[16]

Vědci našli další MSI, zvané zvýšené mikrosatelitní alterace u vybraných tetranukleotidových opakování (EMAST). EMAST je však jedinečný v tom, že není odvozen od MMR a je běžně spojován s TP53 mutace.^[5]

EMAST se vyskytuje u různých druhů rakoviny, včetně rakoviny plic, hlavy a krku, kolorektálního karcinomu, kůže, močových cest a reprodukčních orgánů. Lokality externích orgánů mají větší potenciál pro EMAST. Někteří vědci se domnívají, že EMAST může být důsledkem mutageneze. Pozitivní okraje EMAST u jinak negativních okrajů rakoviny naznačují u pacientů relaps onemocnění.^[17]

Reference

Další čtení