Rozdělení in vitro - In vitro compartmentalization

In vitro rozčlenění (IVC) je emulze - technologie založená na buňkách, která generuje oddíly podobné buňkám in vitro. Tyto přihrádky jsou navrženy tak, aby každá neobsahovala více než jednu gen. Když je gen přepsal a / nebo přeloženo, její výrobky (RNA a / nebo bílkoviny ) se „zachytí“ kódujícím genem uvnitř kompartmentu. Spojením genotyp (DNA ) a fenotyp (RNA, protein), kompartmentalizace umožňuje výběr a vývoj fenotypu.

Dějiny

Metodu kompartmentace in vitro poprvé vyvinuli Tawfik et al.[1] Na základě myšlenky, že Darwinovský evoluce závisí na vazbě genotypu na fenotyp, Tawfik et al. navržené vodné oddíly voda v oleji (bez) emulze napodobovat buněčné oddíly, které se mohou propojit genotyp a fenotyp. Emulze buněčných oddílů byly vytvořeny přidáním in vitro transkripce /překlad reakční směs k míchanému minerálnímu oleji obsahujícímu povrchově aktivní látky. Střední průměr kapiček byl laserovou difrakcí změřen na 2,6 um. Jako důkaz koncepce Tawfik el al. navrhl experiment, který by transkriboval a translatoval gen M. HaeIII v přítomnosti 107násobného přebytku genů kódujících jiný enzym folA. 3 'každého genu byly záměrně navrženy tak, aby obsahovaly sekvence HaeIII R / M, a když byla methyltransferáza HaeIII exprimována z genu M.HaeIII, methylovala sekvenci HaeIII R / M a způsobila, že gen bude rezistentní na štěpení restrikčními enzymy. Výběrem sekvencí DNA, které přežijí štěpení endonukleázou, Tawfik el al. bylo zjištěno, že došlo k obohacení genů M.HaeIII, tj. 1000krát v prvním kole selekce.

Metoda

Obrázek 1. In vitro rozčlenění: výběrový cyklus

Emulzní technologie

Emulze voda v oleji (v / o) se vytvářejí smícháním vodné a olejové fáze pomocí povrchově aktivních látek. Typická emulze IVC je vytvořena nejprve vytvořením směsi oleje a povrchově aktivní látky za míchání a poté postupným přidáváním vodné fáze ke směsi oleje a povrchově aktivní látky. Pro stabilní tvorbu emulze použijte směs HLB (hydrofilní lipofilní rovnováha) a jsou zapotřebí povrchově aktivní látky s nízkým HLB.[2] Některé kombinace povrchově aktivních látek použitých k výrobě směsi olej-povrchově aktivní látka jsou minerální olej / 0,5% Tween 80 / 4,5% Span 80 / deoxycholát sodný[3] a tepelně stabilnější verze, lehký minerální olej / 0,4% Tween 80 / 4,5% rozpětí 80 / 0,05% Triton X-100.[4] Vodná fáze obsahující transkripční a / nebo translační složky se pomalu přidává k olejovým povrchově aktivním látkám a tvorba w / o je usnadněna homogenizací, mícháním nebo použitím zařízení pro ruční vytlačování.

Kvalitu emulze lze určit světlem mikroskopie a / nebo dynamický rozptyl světla techniky. Emulze je docela různorodá a větší homogenizace speed pomáhá vytvářet menší kapičky s užší distribucí velikosti. Je však třeba řídit rychlosti homogenizace, protože rychlost přes 13 500 otáček za minutu má tendenci vést k významné ztrátě aktivity enzymu na úrovni transkripce. Nejčastěji používaná formace emulze poskytuje kapičky se středním průměrem 2–3 μm a průměrným objemem ~ 5 femtolitrů nebo 1010 vodná kapička na ml emulze.[5] Poměr genů k kapičkám je navržen tak, aby statisticky většina kapiček neobsahovala více než jeden gen.

In vitro přepis / překlad

IVC umožňuje miniaturizaci rozsáhlých technik, které lze nyní provádět v mikro měřítku, včetně vázaných in vitro transkripce a překlad (IVTT) experimenty. Zefektivnění a integrace transkripce a překladu umožňuje rychlé a vysoce kontrolovatelné experimentální návrhy.[6][7][8] IVTT lze provést jak v hromadných emulzích, tak v mikrokapkách použitím mikrofluidika na bázi kapiček. Mikrokapky, kapičky na stupnici od piko do femtolitrů, byly úspěšně použity jako nádoby pro jednotlivé molekuly DNA.[9][10] Tato technologie kapiček umožňuje vysokou propustnost analýzy s mnoha různými selekčními tlaky v jednom experimentálním nastavení.[6][10] IVTT v mikrokapkách je upřednostňována, pokud by nadměrná exprese požadovaného proteinu byla toxická pro hostitelskou buňku a minimalizovala tak užitek transkripčních a translačních mechanismů.[11]

Společnost IVC použila pro transkripci a translaci extrakty bakteriálních buněk, pšeničných klíčků a králičích retikulocytů (RRL). Je také možné použít bakteriální rekonstituovaný translační systém, jako je PURE, ve kterém jsou translační komponenty jednotlivě purifikovány a později kombinovány. Při expresi eukaryot nebo komplexních proteinů je žádoucí použít eukaryotický translační systémy, jako je extrakt z pšeničných klíčků nebo lepší alternativa, RRL extrakt. Aby bylo možné použít RRL pro transkripci a translaci, nelze použít tradiční emulzní formulaci, protože ruší translaci. Místo toho byla vyvinuta nová emulzní formulace: 4% Abil EM90 / lehký minerální olej, u které byla prokázána funkční exprese luciferáza a lidské telomeráza.[12]

Rozbití emulze a spojení genotypu a fenotypu

Jakmile je transkripce a / nebo translace dokončena v kapičkách, dojde k rozrušení emulze postupnými kroky odstranění minerálního oleje a povrchově aktivních látek, aby se umožnila následná selekce. V této fázi je zásadní mít metodu „sledování“ všech genových produktů ke kódujícímu genu, protože se volně pohybují v heterogenní populaci molekul. Existují tři hlavní přístupy ke sledování každého fenotypu k jeho genotypu.[13] První metodou je připojení každé molekuly DNA pomocí a biotin skupina a další kódovací sekvence pro streptavidin (STABILNÍ displej).[14] Všechny nově vytvořené proteiny / peptidy budou ve spojení s molekulami streptavidinu a budou se vážit na jejich biotinylovanou kódující sekvenci. Vylepšená verze připojila dvě molekuly biotinu ke koncům molekuly DNA, aby se zvýšila avidita mezi molekulou DNA a peptidy fúzovanými se streptavidinem a použil syntetický gen streptavidinu s nízkým obsahem GC ke zvýšení účinnosti a specificity během amplifikace PCR.[15] Druhou metodou je kovalentní propojení DNA a proteinu. Byly prokázány dvě strategie. Prvním je tvorba fúzních proteinů M.HaeIII.[16] Každý exprimovaný protein / polypeptid bude ve fúzi s doménou Hae III DNA methyltransferázy, která je schopná se kovalentně vázat na fragmenty DNA obsahující sekvenci 5'-GGC * -3 ', kde C * je 5-fluor-2-deoxycytidin. Druhou strategií je použití monomerní mutanty enzymu VirD2.[17] Když je protein / peptid exprimován ve fúzi s proteinem Agrobacterium VirD2, bude se vázat na svou sekvenci kódující DNA, která má jednořetězcový přesah obsahující sekvence rozpoznávající T-hranice VirD2. Třetí metodou je propojení fenotypu a genotypu pomocí perliček.[18] Použité kuličky budou potaženy streptavidinem, aby se umožnila vazba biotinylované DNA, navíc budou kuličky také vykazovat příbuzného vazebného partnera k afinitní značka které budou exprimovány fúzí s proteinem / peptidem.

Výběr

V závislosti na fenotypu, který má být vybrán, budou použity strategie výběru rozdílu. Strategii výběru lze rozdělit do tří hlavních kategorií: výběr pro vazbu, výběr pro katalýzu a výběr pro regulaci.[19] Fenotyp, který má být vybrán, se může pohybovat od RNA přes peptid po protein. Výběrem vazby jsou nejčastěji vyvinutými fenotypy peptid / proteiny, které mají selektivní afinitu k určitému protilátka nebo molekula DNA. Příkladem je výběr proteinů, které mají afinitu k zinkový prst DNA od Seppa a kol.[20] Výběrem pro katalytické proteiny / RNA se obvykle izolují nové varianty s novými nebo zlepšenými enzymatickými vlastnostmi. Například nový ribozym byly vybrány varianty s aktivitou trans-ligázy a vykazovaly několik obratů.[21] Výběrem regulace lze vybrat inhibitory DNA nukleáz, jako jsou proteinové inhibitory kolicin E7 DNázy.[22]

Výhody

Ve srovnání s ostatními in vitro zobrazovací technologie, má IVC dvě hlavní výhody. První výhodou je jeho schopnost řídit reakce uvnitř kapiček. Hydrofobní a hydrofilní složky mohou být dodávány do každé kapičky postupným způsobem, aniž by byla ohrožena chemická integrita kapičky, a tedy řízením toho, co má být přidáno a kdy má být přidáno, je řízena reakce v každé kapičce. Navíc, v závislosti na povaze reakce, která má být provedena, může být také změněno pH každé kapičky. Nověji byly použity fotokazené substráty a jejich účast v reakci byla regulována fotoaktivací.[19] Druhou výhodou je, že IVC umožňuje výběr katalytických molekul. Například Griffiths et al. byl schopen vybrat pro fosfotriesteráza varianty s vyšším Kkočka detekcí tvorby a množství produktu pomocí protilátky proti produktu a průtoková cytometrie resp.[23]

Související technologie

Reference

  1. ^ Tawfik, D.S. a A.D. Griffiths, člověkem vytvořené buněčné oddíly pro molekulární evoluci. Nat Biotechnol, 1998. 16 (7): str. 652–6.
  2. ^ Rothe, A., R.N. Surjadi a B.E. Síla, nové proteiny v emulzích s použitím in vitro rozčlenění. Trends Biotechnol, 2006. 24 (12): str. 587-92.
  3. ^ Tawfik, D.S. a A.D. Griffiths, člověkem vytvořené buněčné oddíly pro molekulární evoluci. Nat Biotechnol, 1998. 16 (7): str. 652-6.
  4. ^ Ghadessy, F.J., J.L. Ong a P. Holliger, Řízená evoluce polymerázové funkce kompartmentovanou autoreplikací. Proč Natl Acad Sci USA, 2001. 98 (8): str. 4552-7.
  5. ^ Miller, O.J. a kol., Řízená evoluce in vitro rozčlenění. Nat Methods, 2006. 3 (7): str. 561-70.
  6. ^ A b Castro-Roa, Daniel; Zenkin, Nikolay (2015). „Metodika pro analýzu transkripce a translace v systémech transkripce vázaných na translaci in vitro“. Metody. 86: 51–59. doi:10.1016 / j.ymeth.2015.05.029. PMID  26080048.
  7. ^ Luke, C (2004). "Produkce serpinu pomocí rychlých systémů transkripce / translace in vitro". Metody. 32 (2): 191–198. doi:10.1016 / s1046-2023 (03) 00211-1. PMID  14698632.
  8. ^ Theberge, Ashleigh B .; Courtois, Fabienne; Schaerli, Yolanda; Fischlechner, Martin; Abell, Chris; Hollfelder, Florian; Huck, Wilhelm T. S. (09.08.2010). „Mikrokapky v mikrofluidice: vyvíjející se platforma pro objevy v chemii a biologii“ (PDF). Angewandte Chemie International Edition. 49 (34): 5846–5868. doi:10.1002 / anie.200906653. ISSN  1521-3773. PMID  20572214.
  9. ^ Kintses, Balint; Vliet, Liisa D van; Devenish, Sean RA; Hollfelder, Florian (2010). „Mikrofluidní kapičky: nové integrované pracovní postupy pro biologické experimenty“. Aktuální názor na chemickou biologii. 14 (5): 548–555. doi:10.1016 / j.cbpa.2010.08.013. PMID  20869904.
  10. ^ A b Courtois, Fabienne; Olguin, Luis F .; Whyte, Graeme; Bratton, Daniel; Huck, Wilhelm T. S .; Abell, Chris; Hollfelder, Florian (2008-02-15). „Integrované zařízení pro monitorování časově závislé exprese in vitro z jednotlivých genů v kapkách Picolitre“. ChemBioChem. 9 (3): 439–446. doi:10.1002 / cbic.200700536. ISSN  1439-7633. PMID  18232037.
  11. ^ Colin, Pierre-Yves; Zinchenko, Anastasia; Hollfelder, Florian (2015). „Enzymové inženýrství v biomimetických kompartmentech“. Aktuální názor na strukturní biologii. 33: 42–51. doi:10.1016 / j.sbi.2015.06.001. PMID  26311177.
  12. ^ Ghadessy, F.J. a P. Holliger, nová emulzní směs pro in vitro kompartmentalizace transkripce a translace v systému králičích retikulocytů. Protein Eng Des Sel, 2004. 17 (3): str. 201-4.
  13. ^ Leemhuis, H. a kol., Nové genotyp-fenotypové vazby pro přímou evoluci funkčních proteinů. Curr Opin Struct Biol, 2005. 15 (4): str. 472-8.
  14. ^ Yonezawa, M. a kol., DNA zobrazení biologicky aktivních proteinů pro in vitro výběr bílkovin. J Biochem, 2004. 135 (3): str. 285-8.
  15. ^ Yonezawa, M., et al., DNA display for in vitro výběr různých peptidových knihoven. Nucleic Acids Res, 2003. 31 (19): str. e118.
  16. ^ Bertschinger, J. a D. Neri, zobrazení kovalentní DNA jako nový nástroj pro řízenou evoluci proteinů in vitro. Protein Eng Des Sel, 2004. 17 (9): str. 699-707.
  17. ^ de Figueiredo, P., R.L. Roberts a E.W. Nester, DARTs: DNA-based in vitro technologie zobrazování polypeptidů. Proteomics, 2004. 4 (10): str. 3128-40.
  18. ^ Nord, O., M. Uhlen a P.A. Nygren, Microbead displej proteinů bezbuněčnou expresí ukotvené DNA. J Biotechnol, 2003. 106 (1): str. 1-13.
  19. ^ A b Griffiths, A.D. a D.S. Tawfik, miniaturizace laboratoře v kapičkách emulze. Trends Biotechnol, 2006. 24 (9): str. 395-402.
  20. ^ Sepp, A. a Y. Choo, Bezbuněčný výběr proteinů vázajících DNA se zinkovým prstem za použití in vitro rozčlenění. J Mol Biol, 2005. 354 (2): str. 212-9.
  21. ^ Levy, M., K.E. Griswold a A.D. Ellington, Přímý výběr trans-působících ligázových ribozymů podle in vitro rozčlenění. Rna, 2005. 11 (10): str. 1555-62.
  22. ^ Bernath, K., S. Magdassi a D.S. Tawfik, řízená evoluce proteinových inhibitorů DNA-nukleáz in vitro kompartmentalizace (IVC) a dodávka nano-kapiček. J Mol Biol, 2005. 345 (5): str. 1015-26.
  23. ^ Griffiths, A.D. a D.S. Tawfik, řízená evoluce extrémně rychlé fosfotriesterázy pomocí IVC. EMBO J, 2003. 22 (1): str. 24-35.