Bioreaktor z dutých vláken - Hollow fiber bioreactor

A Bioreaktor z dutých vláken je trojrozměrný kultivace buněk systém založený na dutých vláknech, která jsou malá, polopropustná kapilární membrány uspořádány v paralelním poli s typickým molekulární váha mezní rozsah (MWCO) 10–30 kDa. Tyto membrány z dutých vláken jsou často svázány a umístěny v trubicovitých polykarbonát skořápky pro vytvoření kazet z bioreaktoru z dutých vláken. V kazetách, které jsou rovněž vybaveny vstupním a výstupním portem, jsou dvě komory: intrakapilární (IC) prostor v dutých vláknech a extrakapilární (EC) prostor obklopující dutá vlákna.

Buňky se naočkují do EC prostoru bioreaktoru z dutých vláken a expandují tam. Buněčné kultivační médium je čerpán prostorem IC a dodává do buněk kyslík a živiny prostřednictvím perfúze membrány z dutých vláken. Jak buňky expandují, jejich odpadní produkty a CO2 také promývají membrány z dutých vláken a jsou unášeny čerpáním média prostorem IC. Vzhledem k tomu, že se odpadní produkty hromadí v důsledku zvýšené buněčné hmoty, lze také zvýšit rychlost toku média, takže růst buněk není inhibován toxicitou odpadních produktů.

Protože tisíce dutých vláken mohou být zabaleny do jediného bioreaktoru z dutých vláken, zvyšují plocha povrchu kazety značně. Výsledkem je, že buňky mohou vyplnit prostor EC na hustotu> 108 buněk / ml. Samotná kazeta však zabírá velmi malý objem (často objem 12 oz plechovky sody). Skutečnost, že bioreaktory z dutých vláken jsou velmi malé a přesto umožňují neuvěřitelně vysokou hustotu buněk, vedla k jejich vývoji jak pro výzkum, tak pro komerční aplikace, včetně monoklonální protilátka a vakcína proti chřipce[1] Výroba. Stejně tak proto, že bioreaktory z dutých vláken spotřebovávají podstatně méně středních a růstových faktorů než tradiční metody buněčných kultur, jako jsou bioreaktory s míchanou nádrží, nabízejí významnou úsporu nákladů. Nakonec jsou bioreaktory z dutých vláken prodávány jako jednorázové jednorázové použití, což vede k významné časové úspoře pro pracovníky laboratoře a techniky.

Dějiny

V roce 1972 Richard Knazek[2] skupina u NIH hlásil, jak myš fibroblasty kultivované na 1,5 cm3 kapilární membrány z dutých vláken složené z acetát celulózy byli schopni vytvořit uzliny o šířce 1 mm za 28 dní. Skupina zaznamenala konečný počet buněk jako přibližně 1,7 x 107 buňky ze startovací dávky pouze 200 000 buněk. Když stejná skupina kultivovala člověka choriokarcinom buňky na polymerních a silikonových polykarbonátových kapilárních membránách o celkové velikosti méně než 3 cm3 v objemu se buňky rozšířily na množství přibližné 2,17 x 108 buňky.

V roce 1974 získala skupina Knazek patent na technologii bioreaktorů z dutých vláken.[3] Na základě této patentované technologie začaly společnosti budovat bioreaktory s dutými vlákny v různých a větších (komerčních) měřítcích, přičemž k významnému rozvoji a technologickému zdokonalení došlo na konci 80. let až na počátku 90. let. Do roku 1990 byly hlášeny nejméně tři společnosti nabízející komerčně dostupné bioreaktory z dutých vláken.[4]

Jeden technický pokrok zahrnoval přidání výměnné patrony plynu, což umožnilo lepší kontrolu nad systémem pH a hladiny kyslíku. Podobně jako a savčí plíce, patrona pro výměnu plynů účinně okysličovala kultivační médium, což umožnilo bioreaktoru podporovat vyšší počet buněk. V kombinaci se schopností přidat nebo odebrat CO2 pro přesnou kontrolu pH byla odstraněna omezení běžně spojená s buněčnou kulturou ve velkém měřítku, což vedlo k hustě zabaleným buněčným kulturám, které mohly být udržovány několik měsíců.

Kromě toho, kontrola nad dynamika tekutin v každém bioreaktoru z dutých vláken vedlo k další optimalizaci prostředí buněčné kultury. Střídáním tlakový gradient přes membránu z dutých vláken by médium mohlo proudit tam a zpět mezi EC stranou (komora buněk) a IC stranou (lumen dutého vlákna). Tento proces v kombinaci s axiálním tokem média vytvořeným při průchodu média po délce vláken optimalizoval růstové prostředí v celém bioreaktoru.

Tento koncept se nazývá EC Cycling,[5] a byl vyvinut jako řešení gradientů, které se tvoří v bioreaktorech z dutých vláken, když je médium tlačeno dolů po délce jejich vláken. Vyšší hydrostatický tlak na axiálním konci (médium vstupující do lumen vlákna) ve srovnání s distálním koncem bioreaktoru vytváří a Špačkový tok v prostoru EC, což je podobné tomu, co je pozorováno v těle. Tento jev také vytváří v bioreaktoru axiální oblast bohatou na živiny a distální oblast s nedostatkem živin. Začleněním EC cyklování jsou eliminovány účinky toku Starling a celý bioreaktor se stává bohatým na živiny a optimalizován pro růst buněk.

Je třeba dosáhnout optimálních rychlostí promývání prostoru IC a EC, aby bylo možné účinně dodávat živiny pro média a doplňky pro růst a sbírat supernatant. Během fáze buněčného růstu v těchto bioreaktorech se zvyšuje rychlost podávání média, aby se přizpůsobila expandující populaci buněk. Přesněji řečeno, rychlost perfúze IC média se zvyšuje, aby poskytla buňkám další glukózu a kyslík, zatímco se neustále odstraňuje metabolické odpady jako kyselina mléčná. Když je buněčný prostor zcela vyplněn buňkami, je rychlost podávání média plošinami, což má za následek konstantu glukóza spotřeba, spotřeba kyslíku a rychlost produkce laktátu.

Aplikace

Se zavedením technologie hybridomů v roce 1975[6] buněčná kultura by mohla být použita ke generování vylučovaných proteinů, jako jsou monoklonální protilátky, růstové hormony, a dokonce i některé kategorie vakcín. Aby bylo možné tyto proteiny produkovat v komerčním měřítku, musely být vyvinuty nové způsoby kultivace velkých dávek buněk. Jedním takovým technologickým vývojem byl bioreaktor z dutých vláken.

Bioreaktory z dutých vláken se používají ke generování vysokých koncentrací produktů pocházejících z buněk, včetně monoklonálních protilátek, rekombinantní proteiny růstové faktory, viry a viru podobné částice. To je možné, protože semipermeabilní membrány z dutých vláken umožňují průchod nízkomolekulárních živin a odpadu z EC obsahujícího buňky do prostoru IC neobsahujícího buňky, ale neumožňují průchod větších produktů, jako jsou protilátky. Proto, když se buněčná linie (např. Hybridom) rozpíná a exprimuje cílový protein, zůstává tento protein v EC prostoru a není vyplavován. V daném časovém bodě (nebo nepřetržitě během kultivace) se supernatant (produkt) ze sklizně shromáždí, vyčeří a ochladí pro budoucí následné použití.

Menší bioreaktory z dutých vláken se často používají pro výběr a optimalizaci buněčné linie[7][8] před přechodem k větším systémům pro kultivaci buněk. Tímto způsobem ušetříte náklady na růstový faktor, protože významná část média pro buněčnou kulturu nevyžaduje přidání drahých složek, jako je fetální hovězí sérum. Stejně tak mohou být menší bioreaktory z dutých vláken uloženy v laboratorním inkubátoru, stejně jako destičky a baňky pro buněčné kultury.

Nedávno byly bioreaktory z dutých vláken testovány jako nové platformy pro komerční produkci viru chřipky A s vysokým titrem.[9] V této studii byly adherentní i suspenzní psí ledvinové epitelové buňky (MDCK) Madin-Darby infikovány dvěma různými kmeny chřipky: A / PR / 8/34 (H1N1) a pandemickým kmenem A / Mexico / 4108/2009 ( H1N1). Bylo dosaženo vysokých titrů jak pro kmeny suspenze, tak pro adherentní kmeny; kromě toho byla technologie výroby bioreaktorů s dutými vlákny shledána srovnatelnou ve své výrobní kapacitě s ostatními komerčními bioreaktory na trhu, včetně klasických míchaných a vlnových bioreaktorů (Wave) a perfúzních systémů ATF.

Reference

  1. ^ Hirschel M, Gangemi JD, McSharry J., Myers C. Nové využití pro bioreaktory s dutými vlákny Zprávy o genetickém inženýrství 15. června 2011 (sv. 31, č. 12).
  2. ^ Knazek RA, Gullino PM, Kohler PO, Dedrick RL. Buněčná kultura na umělých kapilárách: přístup k růstu tkáně in vitro. Věda. 1972 6. října; 178 (4056): 65-6.
  3. ^ Buněčná kultura na semipermeabilních tubulárních membránách US patent US 3821087 A
  4. ^ Ahern, H. Systémy bioreaktorů s dutými vlákny zvyšují výtěžek buněčné kultury Časopis Scientist (1990)
  5. ^ Systém extrakapilárního cyklování tekutin a metoda pro buněčnou kulturu. Patent USA US 20130058907 A1
  6. ^ Kohler, G. a C. Milstein. 1975. Kontinuální kultury fúzovaných buněk vylučujících protilátky předem definované specificity. Příroda 256: 495.
  7. ^ Gramer, MJ. Britton TL. Výběr a izolace buněk pro optimální růst v bioreaktorech s dutými vlákny Hybridoma 2000. 19 (5): 407-412.
  8. ^ De Napoli, Ilaria E .; Zanetti, Elisabetta M .; Fragomeni, Gionata; Giuzio, Ermenegildo; Audenino, Alberto L .; Catapano, Gerardo (2014). „Transportní modelování bioreaktorů s membránou z dutých vláken s konvekcí pro terapeutické aplikace“. Journal of Membrane Science. 471: 347–361. doi:10.1016 / j.memsci.2014.08.026.
  9. ^ Tapia, F. et al. Výroba lidského viru chřipky A s vysokým titrem s adherujícími a suspenzními buňkami MDCK kultivovanými v bioreaktoru z dutých vláken na jedno použití Vaccine 32 (2014): 1003-1011.