Stanovení HUMARA - HUMARA assay

Stanovení HUMARA je jednou z nejpoužívanějších metod pro stanovení klonálního původu nádoru.^[1][2] Metoda je založena na Inaktivace chromozomu X a má tu výhodu, že má jiné methylace stav genu zvaného HUMARA (zkratka pro člověka androgenní receptor ), který je umístěn na X chromozom. Vzhledem k tomu, že jakmile je jeden chromozom X inaktivován v buňce,^[3] všechny ostatní buňky z něj odvozené budou mít deaktivován stejný chromozom X, tento přístup se stane skvělým nástrojem k odlišení monoklonální populace z polyklonální v ženské tkáni. Gen HUMARA má zejména tři důležité vlastnosti, díky nimž je pro tento účel velmi vhodný.

1-) Gen se nachází na chromozomu X a normálně prochází inaktivací methylací embryogeneze kojence ženy.^[3] Skutečnost, že většina, ale ne všechny geny na chromozomu X, prochází inaktivací, se stává touto funkcí důležitou.

2-) Gen lidského androgenního receptoru alely mají různé počty opakování CAG.^[4] Takže kdy DNA ze zdravé ženské tkáně je zesíleno PCR pro specifickou oblast genu lze na gelu vidět dva oddělené pruhy.

3-) Oblast, která je amplifikována pomocí PCR, má také určité základní objednávky, díky nimž je náchylné k trávení HpaII (nebo Hhal) enzym, pokud není methylovaný.^[4] Tento detail dává vědcům příležitost odlišit methylovanou alelu od nemetylované.

Díky těmto vlastnostem genu HUMARA lze určit klonální původ jakékoli tkáně ze samičího savčího organismu.

Základní proces se provádí následujícím způsobem:

1-) DNA z tkáně je izolována.

2-) Izolovaná DNA je ošetřena vhodným enzymem (jako je HpaII) za optimálních podmínek po navrhovanou dobu (tj. Přes noc).

3-) DNA se vyčistí a určitá oblast genu HUMARA se amplifikuje pomocí PCR za použití „vhodných“ primerů (jako příklad viz: Ref.2)

4-) Po provedení produktů PCR gelem se gel vizualizuje a výsledky se odpovídajícím způsobem analyzují. Pokud jsou patrné dva pruhy, je studovaná tkáň s největší pravděpodobností polyklonálního původu. Pokud je pozorován jediný pás, tkáň je monoklonální, pokud dvě alely nemají přesně stejný počet opakování CAG nebo různé buňky se stejnou inaktivovanou iniciují nádor; zdánlivě monoklonální, i když je ve skutečnosti polyklonální.

Aby bylo možné učinit závěr o klonalitě nádoru, je nejlepší použít DNA z normální tkáně stejné osoby a jako kontrola musí být také amplifikován vzorek bez enzymového ošetření. Pokud je i v normálních tkáních bez působení enzymu pozorován jeden pás, lze to vysvětlit následovně; tato osoba má genetický vzorec jako XO (tuto možnost lze vyloučit, aby se po ošetření enzymem objevil pruh, protože pokud je skutečně XO genetickým vzorem vzorku, pak nebude existovat ŽÁDNÁ methylace, proto by po trávení neměl být viditelný žádný pruh s enzymem. V případě, že se po léčbě enzymem objeví pruh, bude s největší pravděpodobností pozorování znamenat, že osoba má dva chromozomy X s přesnými opakováními CAG.) Když uvidíte dva pruhy pro normální tkáň (jak s enzymem, tak s neošetřeným) , a uvidíte dva pruhy pro vzorek tumoru ošetřeného enzymem, ale dva pruhy pro neošetřenou DNA tumoru, pak se určitě díváte na polyklonální tumor. Pokud však po enzymovém ošetření uvidíte stejný počet pásů pouze s jedním pásem, existuje poměrně vysoká šance, že váš nádor bude monoklonální. V tomto posledním případě není monoklonalita jistá, protože, jak již bylo uvedeno výše, existuje možnost mít přesně stejná opakování -CAG- na obou alelách.

Reference