FlAsH-EDT2 - FlAsH-EDT2 - Wikipedia

FlAsH-EDT2
FlAsH-EDT2.svg
Jména
Ostatní jména
Vazebné sponky do vlasů s arzenikem z fluoresceinu; Lumio zelená
Identifikátory
3D model (JSmol )
ChEBI
ChEMBL
ChemSpider
Vlastnosti
C24H18Tak jako2Ó5S4
Molární hmotnost664.49 g · mol−1
VzhledPevný
Bod tání 169 až 172 ° C (336 až 342 ° F; 442 až 445 K)
Pokud není uvedeno jinak, jsou uvedeny údaje o materiálech v nich standardní stav (při 25 ° C [77 ° F], 100 kPa).
Reference Infoboxu

FlAsH-EDT2 je organoarsenická sloučenina s molekulární vzorec C24H18Tak jako2Ó5S4. Jeho struktura je založena na a fluorescein jádro se dvěma 1,3,2-dithiarsolane substituenty. Používá se v bioanalytickém výzkumu jako fluorescenční štítek pro vizualizaci bílkoviny v živých buňkách.[1] FlAsH-EDT2 je zkratka pro fluorescin arsenický hairpin pořadač -Ezemandithiol, a je světle žlutá nebo narůžovělá fluorogenní pevná látka. Má polostrukturní vzorec (C2H4Osel2)2-(C13H5Ó3)-C6H4COOH, představující dithiarsolanové substituenty vázané na hydroxyxanthon jádro, připojené k Ó- substituovaný molekula kyselina benzoová.

FlAsH-EDT2 se používá pro místně specifické značení, selektivně se váží na proteiny obsahující tetracystein (TC) motiv Cys-Cys-Xxx-Xxx-Cys-Cys a po navázání se stávají fluorescenčními. Zobrazuje nespecifickou vazbu na endogenní proteiny bohaté na cystein, což znamená, že se váže na jiná místa, než která jsou předmětem zájmu (CCXXCC). Další optimalizace motivu TC odhalila zlepšenou vazebnou afinitu FlAsH pro motiv CCPGCC,[2] a vyšší kvantový výnos když je tetracysteinový motiv lemován specifickými zbytky (HRWCCPGCCKTF nebo FLNCCPGCCMEP).[3]

Příprava

Krok 1: HgO v TFA; Krok 2: AsCl3, následován Pd (OAc)2 a DIEA; Krok 3: H2EDT ve vodném acetonu.

FlAsH-EDT2 lze připravit ve třech krocích od fluorescein (viz obrázek).[1]

Tvorba FlAsH-TC aduktu

Sloučeniny arsenu.png

Mnoho studií ukazuje, že sloučeniny trojmocného arsenu se vážou na páry cysteinových zbytků. Tato vazba je zodpovědná za toxicitu mnoha sloučenin arsenu.[4] Vazba je obrácena 1,2-ethandithiolem, který se pevně váže na sloučeniny arsenu, jak ukazuje stabilita FlAsH-EDT2.[5] Taková silná vazba síra-arsen může být opět regulována navržením peptidové domény, která vykazuje vyšší afinitu k arsenu, jako je tetracysteinový motiv. Modulací vzdálenosti mezi dvěma páry cysteinových zbytků a prostorem mezi centry arsenu FlAsH-EDT2bylo možné dosáhnout kooperativní a entropicky zvýhodněné dithiolové vazby arsenu.[6]

Tvorba FlAsH-TC aduktu

Vazba FlAsH-EDT2 je tedy předmětem rovnováhy. Tvorba aduktu FlAsH-peptid může být upřednostňována při nízké koncentraci EDT (pod 10μM ) a být obrácen ve vysoké koncentraci EDT (nad 1 mM).[6]

Vlastnosti

FlAsH se stane fluorescenčním po navázání tetracysteinového motivu. Je excitován při 508 nm a emituje 528 nm, zelenožlutý, volného fluoresceinu. The kvantový výnos je 0,49 pro 250 nM FlAsH se váže na modelový peptid obsahující tetracystein ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku při pH 7,4.[6]

Obecně platí, že FlAsH-EDT2 má 0,1-0,6 fluorescenční kvantové účinnosti s několika detekčními limity μM pro difúzní cytosolickou značku a 30-80 extinkční koeficienty L mmol−1 cm−1. Ukázal se také komplex FlAsH-peptid přenos energie fluorescenční rezonance (FRET) z fluorescenčních proteinů, například ze zesíleného azurového fluorescenčního proteinu (ECFP) z Zelený fluorescenční protein (GFP).[7]

aplikace

FlAsH-EDT2 umožňuje méně toxické a specifičtější fluorescenční značení, které je propustné pro membránu.[8] Modifikace fluoresceinové skupiny také umožňuje vícebarevnou analýzu.[9] Ukázalo se, že je dobrou alternativou k zeleným fluorescenčním proteinům (GFP) s výhodou, že FlAsH-EDT2 je mnohem menší (molární hmotnost  < 1 kDa ) ve srovnání s GFP (~ 30 kDa), čímž se minimalizuje narušení aktivity proteinu ve studii.[1][10]

Použití

V minulosti FlAsH-EDT2 byl široce používán ke studiu řady in vivo buněčné události a subcelulární struktury ve zvířecích buňkách, protein matrice viru Ebola a nesprávné skládání proteinů. S elektronovým mikroskopickým zobrazováním FlAsH-EDT2 se také používá ke studiu procesů obchodování s bílkovinami in situ.[11] Více nedávno, to bylo používáno v rozšířené studii rostlinných buněk, jako je Arabidopsis a tabák.[12]

Reference

  1. ^ A b C Adams, Stephen R .; Tsien, Roger Y. (2008). „Příprava membránou prostupujících biarsenikálů FlAsH-EDT2 a ReAsH-EDT2 pro fluorescenční značení proteinů značených tetracysteinem ". Nat. Protoc. 3 (9): 1527–1534. doi:10.1038 / nprot.2008.144. PMC  2843588. PMID  18772880.
  2. ^ Adams, Stephen R .; Campbell, Robert E .; Gross, Larry A .; Martin, Brent R .; Walkup, Grant K .; Yao, Yong; Llopis, Juan; Tsien, Roger Y. (2002). "Nové biarsenické ligandy a tetracysteinové motivy pro značení proteinů in vitro a in vivo: syntéza a biologické aplikace". Journal of the American Chemical Society. 124 (21): 6063–6076. doi:10.1021 / ja017687n.
  3. ^ Martin, Brent R .; Giepmans, Ben NG; Adams, Stephen R .; Tsien, Roger Y. (2005). "Savčí buněčná optimalizace biarsenikálně vázajícího tetracysteinového motivu pro lepší fluorescenci a afinitu". Přírodní biotechnologie. 23 (10): 1308. doi:10.1038 / nbt1136.
  4. ^ Kalef, Edna; Gitler, Carlos (1994). „Čištění proteinů obsahujících diciol v okolí pomocí afinitní chromatografie na bázi arsenu.“. V Sies, Helmut (ed.). Kyslíkové radikály v biologických systémech, část C.. Metody v enzymologii. 233. Akademický tisk. 395–403. doi:10.1016 / S0076-6879 (94) 33046-8. ISBN  9780080883465.
  5. ^ Whittaker, Victor P. (1947). „Experimentální zkoumání„ prstenové hypotézy “arsenické toxicity“. Biochem. J. 41 (1): 56–62. doi:10.1042 / bj0410056. PMC  1258423. PMID  16748119.
  6. ^ A b C Griffin, B. Albert; Adams, Stephen R .; Tsien, Roger Y. (1998). "Specifické kovalentní značení rekombinantních proteinových molekul uvnitř živých buněk". Věda. 281 (5374): 269–272. Bibcode:1998Sci ... 281..269G. doi:10.1126 / science.281.5374.269. PMID  9657724.
  7. ^ Adams, Stephen R .; Campbell, Robert E .; Gross, Larry A .; Martin, Brent R .; Walkup, Grant K .; Yao, Yong; Llopis, Juan; Tsien, Roger Y. (2002). „Nové biarsenikální ligandy a tetracysteinové motivy pro označování proteinů in vitro a in vivo: syntéza a biologické aplikace“. J. Am. Chem. Soc. 124 (21): 6063–6076. doi:10.1021 / ja017687n.
  8. ^ Hoffmann, Carsten; Gaietta, Guido; Zürn, Alexander; Adams, Stephen R .; Terrillon, Sonia; Ellisman, Mark H .; Tsien, Roger Y .; Lohse, Martin J. (2010). „Fluorescenční značení proteinů značených tetracysteinem v intaktních buňkách“. Přírodní protokoly. 5 (10): 1666. doi:10.1038 / nprot.2010.129. PMC  3086663.
  9. ^ https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/cellular-imaging/high-content-screening/flash-and-reash.html
  10. ^ Griffin, B. Albert; Adams, Stephen R .; Jones, Jay; Tsien, Roger Y. (2000). "Fluorescenční značení rekombinantních proteinů v živých buňkách pomocí FlAsH". V Thorner, Jeremy; Emr, Scott D.; Abelson, John N. (eds.). Aplikace chimérických genů a hybridních proteinů, část B: Buněčná biologie a fyziologie. Metody v enzymologii. Akademický tisk. 565–578. doi:10.1016 / S0076-6879 (00) 27302-3. ISBN  9780080496825.
  11. ^ Gaietta, Guido; Deerinck, Thomas J .; Adams, Stephen R .; Bouwer, James; Tour, Oded; Laird, Dale W .; Sosinsky, Gina E .; Tsien, Roger Y.; Ellisman, Mark H. (2002). "Vícebarevné a elektronové mikroskopické zobrazování obchodování s connexinem". Věda. 296 (5567): 503–507. Bibcode:2002Sci ... 296..503G. doi:10.1126 / science.1068793. PMID  11964472.
  12. ^ Estévez, José M .; Somerville, Chris (2006). "FlAsH založené fluorescenční zobrazování živých buněk syntetických peptidů exprimovaných v Arabidopsis a tabák ". Biotechniky. 41 (5): 569–574. doi:10.2144/000112264.