Delitto perfetto - Delitto perfetto

Delitto perfetto (Italština:[deˈlitto perˈfɛtto]) je genetická technika pro in vivo místně zaměřená mutageneze v droždí. Tento název je italský výraz pro „dokonalou vraždu“ a odkazuje na schopnost techniky vytvářet požadované genetické změny, aniž by v DNA zůstala cizí DNA genom.

Pozadí

Tato technika byla vyvinuta skupinou na Národní ústav environmentálních zdravotnických věd (NIEHS) ve složení Michael A. Resnick, Francesca Storici (nyní na Georgia Institute of Technology) a L. Kevin Lewis (nyní na Southwest Texas State University). Metoda používá syntetické oligonukleotidy v kombinaci s buněčným procesem homologní rekombinace. V důsledku toho je vhodný pro genetickou manipulaci s kvasinkami, která má vysoce účinnou homologní rekombinaci. The delitto perfetto byl použit přístup k produkci jednobodových a vícebodových mutací, zkrácení nebo vložení genů a delecí celých genů (včetně základních genů).

Výhody

Hlavní výhodou této techniky je její schopnost eliminovat jakoukoli cizí DNA z genomu po procesu mutageneze. Tím je zajištěno, že neexistují žádné volitelné značky nebo exogenní sekvence používané pro zacílení vlevo v genomu, které mohou způsobit nepředvídané účinky.

The delitto perfetto technika je také jednodušší ve srovnání s jinými metodami pro in vivo místně zaměřená mutageneze. Jiné metody vyžadují několik klonovacích kroků a jsou rozsáhlé Sekvenování DNA k potvrzení mutageneze, což je často komplikovaný a neefektivní proces.[1][2][3]

Tento přístup má velkou flexibilitu, protože po vložení kazety CORE (podrobnosti viz Přehled metod) lze snadno a rychle provést více mutací v požadovaném genu.

Tuto metodu lze použít na jiné organismy, kde je účinná homologní rekombinace, například na mech Physcomitrella patens, Kuřecí buňky DT40 nebo E-coli. Kromě toho lze studovat lidské geny a podobně geneticky manipulováno v droždí pomocí kvasinkové umělé chromozomy (YAC).

Nevýhody

Protože delitto perfetto technika je založena na homologní rekombinaci, aby tento postup fungoval, musí být tento proces funkční v buňkách. v Saccharomyces cerevisiae, RAD52 Gen je nezbytný pro homologní rekombinaci, a proto je nezbytný pro delitto perfetto metoda.

Metoda je užitečná pouze pro aplikace, kde volitelné značky nejsou nutné. Například mutagenizované kmeny kvasinek nelze použít pro další genetickou analýzu, jako je analýza tetrad. Značky by musely být vloženy do příslušného místa v samostatném procesu.

Technické nevýhody

  • Náklady na oligonukleotidy
  • Mutageneze je omezena na oblast genomu obklopující vloženou kazetu
  • Omezený počet reportérské geny (omezeno dostupnými kazetami CORE)
  • Nízká účinnost pro určité aplikace (např. Odstranění základních genů)

Přehled metod

Delitto Perfetto je dvoustupňová metoda pro in vivo mutageneze. V počátečním kroku je kazeta CORE vložena do oblasti zájmu homologní rekombinací. Následně je kazeta CORE nahrazena DNA obsahující požadovanou mutaci.

Obrázek 1. ZÁKLADNÍ kazety pro Delitto Perfetto

ZÁKLADNÍ kazety

Kazeta CORE obsahuje jak a COnevybratelná značka a REgen porter. Reportérový gen umožňuje selekci kvasinkových buněk, které obdrží kazetu CORE během prvního kroku procesu. Proteselektovatelný marker umožňuje selekci kvasinkových buněk, které ztrácejí kazetu CORE integrací mutovaného oligonukleotidu během druhého kroku procesu.

Existuje řada kazet CORE, ze kterých si můžete vybrat, které obsahují celou řadu reportérských genů, protisměrné výrobce a další funkce.[4]

Reportérské geny

  • kanMX4 - umožňuje růst v médiích obsahujících Geneticin
  • hyg - umožňuje růst v médiích obsahujících Hygromycin B..

Vybíratelné značky

  • KlURA3 - zabraňuje růstu v médiu obsahujícím kyselinu 5-fluororotovou.
  • GAL1 / 10-p53 - zabraňuje růstu v médiu obsahujícím galaktóza. Kóduje toxického mutanta p53 pod GAL1 promotér.[5]

Další funkce

  • GAL1-I-SceI - Zvyšuje účinnost cílení na chromozom obsahující kazetu CORE v diploidních buňkách. Obsahuje restrikční endonukleáza SceI pod GAL1 promotor a cílová sekvence SceI.[6][7]
Obrázek 2. Přehled oDelitto Perfetto pro odstranění genů

Pracovní postup

Nejprve je kazeta CORE zesílena o PCR s primery obsahujícími oblasti homologie s chromozomálním místem, kde bude vloženo. Kazeta CORE je integrována pomocí homologní rekombinace. Buňky obsahující kazetu CORE mohou být vybrány pro použití reportérového genu a mohou být dále potvrzeny pomocí proteselektovatelného markeru. Integraci kazety CORE ve správném chromozomálním umístění lze ověřit pomocí PCR pomocí primerů, které hybridizují před integračním místem, uvnitř CORE a za integrační velikostí, které jsou navrženy tak, aby generovaly fragmenty 500–1500 bp.[4]

Kvasinkové buňky obsahující CORE jsou transformovány oligonukleotidy obsahujícími požadovanou mutaci tak, že vedou ke ztrátě kazety CORE během homologní rekombinace. Transformanty se vybírají pomocí proteselektovatelného markeru a lze je dále skrínovat pomocí reportérového genu. Sekvenování se používá k zajištění, že byla vygenerována správná mutace bez dalších mutací. Případně, pokud mutace vede k vytvoření nebo ztrátě restrikčního místa, lze použít PCR následovanou restrikčním štěpením k potvrzení, že byla integrována požadovaná mutace.[4]

Zprostředkováno dvouvláknové přerušení (DSB) delitto perfetto

Ke zvýšení cílení oligonukleotidů na CORE kazetu, CORE kazety obsahující GAL1-I-SceFunkci I lze použít. Tato funkce umožňuje expresi SceI, endonukleázy, která rozpoznává vysoce jedinečnou 18 nukleotidovou sekvenci, která se pravděpodobně nikde jinde v S. cerevisiae genom. Endonukleáza SceI je schopna generovat DSB v místě SceI, což vede k náboru Oprava DNA stroje.[8] To zvyšuje frekvenci cílené homologní rekombinace 4 000krát ve srovnání s případy, kdy není generován žádný DSB.[6]

Obecná hlediska návrhu oligonukleotidů

80–100 bp oligonukleotidů lze generovat jako jednotlivé molekuly nebo páry oligonukleotidů, které se zcela překrývají nebo částečně překrývají. Doporučený typ oligonukleotidu závisí na typu mutace a vzdálenosti od místa integrace kazety CORE, kde je požadována mutace.

Delší oligonukleotidy vedou ke zvýšení účinnosti transformace. Plně komplementární páry oligonukleotidů vedou k 5–10násobnému zvýšení účinnosti ve srovnání s jednotlivými oligonukleotidy a jsou doporučeny pro všechny aplikace.[4][9] Poskytují však malé okno mutageneze pouze 20–40 bází z kazety CORE. Ke zvýšení okna mutageneze lze použít oligonukleotidové páry s překrytím 20 bp, které umožňují cílení až 100 bp před a za integračním místem CORE. Transformují se však přibližně 6krát méně efektivně. Pro zvýšení účinnosti lze prodloužit částečně překrývající se oligonukleotidy in vitro.[9]

Pro genové delece

Jsou navrženy oligonukleotidy obsahující sekvenci upstream bezprostředně následovanou sekvencí downstream od oblasti, která má být vyřazena. U delečních genů vedou páry plně překrývajících se 80–100 bp oligonukleotidů k ​​5–10násobnému zvýšení účinnosti transformace než jednotlivé oligonukleotidy.[4]

Pro bodové mutace

U mutací 20 až 40 bp z kazety CORE se doporučuje 80–100 bp plně překrývajících se oligonukleotidů. U mutací s více než 40 bp z kazety CORE musí být použity částečně překrývající se oligonukleotidy. Pro zvýšení jejich transformační účinnosti se doporučuje prodloužit částečně překrývající se oligonukleotidy in vitro.[4][6][9]

Pro základní geny

Ke generování mutantů esenciálních genů může být kazeta CORE vložena za požadovaný gen, ale to omezuje oblasti genu dostupné pro mutaci. Alternativně lze použít diploidní buňky. Použití diploidu však snižuje účinnost cílení na oligonukleotidy v důsledku přítomnosti dvou vhodných chromozomálních míst pro rekombinaci oligonukleotidů. K řešení této nevýhody lze použít metodu delitto perfetto zprostředkovanou DSB. To zvyšuje frekvenci cílené homologní rekombinace 700krát ve srovnání s případy, kdy není generován žádný DSB. Navíc je 2–5krát účinnější než jiné dostupné metody.[6][9]

Míra pozadí mutace

Uvádí se, že pokud nejsou generovány žádné dvouvláknové zlomy, počet buněk, které ztratí kazetu CORE v nepřítomnosti zacilujícího oligonukleotidu, je menší než jeden transformant na 107 životaschopné buňky. Naproti tomu se tento počet zvyšuje až na 100 transformantů na 107 životaschopné buňky, když je generován dvouvláknový zlom. V diploidu dochází ke zvýšeným rychlostem mutací pozadí v důsledku homologní rekombinace s homologním chromozomem snižujícím cílené transformační události pouze na 4% celkových transformantů.[6]

Reference

  1. ^ Erdeniz N., Mortensen UH., Rothstein R. (1997) Metody nahrazení alely bez klonování pomocí PCR. Genome Res. 7: 1174-83.
  2. ^ Langle-Rouault F., Jacobs E. (1995) Metoda provádění přesných změn v genomu kvasinek pomocí recyklovatelného selekčního markeru. Nucleic Acids Res. 23: 3079-81.
  3. ^ Scherer S., Davis RW. (1979) Nahrazení chromozomových segmentů vytvořenými pozměněnými sekvencemi DNA in vitro. Proč Natl Acad Sci. 76: 4951-5.
  4. ^ A b C d E F Storici F., Resnick MA. (2006) Přístup delitto perfetto k in vivo místně zaměřená mutageneze a přesmyky chromozomů se syntetickými oligonukleotidy v kvasinkách. Metody Enzymol. 409: 329-45.
  5. ^ Inga A., Resnick MA. (2001) Nové lidské mutace p53, které jsou toxické pro kvasinky, mohou zvýšit transaktivaci specifických promotorů a reaktivních mutantů p53. Onkogen. 14; 20 (27): 3573-9
  6. ^ A b C d E Storici F., Durham CL., Gordenin DA., Resnick MA. (2003) Chromozomální místně specifické dvouřetězcové zlomy jsou účinně zaměřeny na opravu pomocí oligonukleotidů v kvasinkách. Proč Natl Acad Sci. 9; 100 (25): 14994-9
  7. ^ Plessis A., Perrin A., Haber JE., Dujon B. (1992) Místně specifická rekombinace určená I-Scel, mitochondriální skupina I intronově kódovaná endonukleáza exprimovaná v jádru kvasinek. Genetika. 130 (3): 451-60
  8. ^ Storici F., Resnick MA. (2003) Delitto perfetto cílená mutageneze v kvasinkách s oligonukleotidy. Genet Eng. 25: 189-207
  9. ^ A b C d Storici F., Lewis LK., Resnick MA. (2001) In vivo místně zaměřená mutageneze s použitím oligonukleotidů. Nat Biotechnol. 19 (8): 773-6