Sekvenování DNA nanoballů - DNA nanoball sequencing

Pracovní postup pro sekvenování DNA nanoballů[1]

Sekvenování DNA nanoballů je vysoce výkonné sekvenování technologie, která se používá k určení celku genomová sekvence organismu. Metoda používá replikace postupného kruhu amplifikovat malé fragmenty genomové DNA do DNA kuličky. Fluorescenční nukleotidy se vážou na komplementární nukleotidy a poté se polymerují k ukotvení sekvencí vázaných ke známým sekvencím na templátu DNA. Základní pořadí se určuje pomocí fluorescence vázaných nukleotidů[2] Tento Sekvenování DNA metoda umožňuje sekvenování velkého počtu nanobulíků DNA za běh při nižším činidlo náklady ve srovnání s ostatními sekvenování nové generace platformy.[3] Omezením této metody je však to, že generuje pouze krátké sekvence DNA, což představuje výzvu pro mapování jejích čtení na referenční genom.[2] Po zakoupení Complete Genomics, Pekingský institut pro genomiku (BGI) rafinovaný Sekvenování DNA nanoballů sekvenovat vzorky nukleotidů na jejich vlastní platformě.[4][5]

Postup

Sekvenování DNA nanoball zahrnuje izolaci DNA který má být sekvenován, rozřezáním na malé 100 - 350 základní pár (bp) fragmenty, ligace adaptujte sekvence na fragmenty a cirkularizujte fragmenty. Kruhové fragmenty jsou zkopírovány replikace postupného kruhu což má za následek mnoho jednovláknových kopií každého fragmentu. DNA kopíruje zřetězit hlavu k ocasu v dlouhém řetězci a je zhutněna do nanobulky DNA. Nanočástice tedy jsou adsorbovaný na sekvenční průtokovou celu. Barva fluorescence v každé vyšetřované poloze je zaznamenáno kamerou s vysokým rozlišením. Bioinformatika se používají k analýze fluorescenčních dat a k provedení základního volání ak mapování nebo kvantifikaci 50bp, 100bp nebo 150bp jednoduchých nebo spárovaných čtení.[6][2]

Izolace DNA, fragmentace a zachycení velikosti

Buňky jsou lyžoval a DNA je extrahován z cely lyzát. Vysokomolekulární DNA, často dlouhá několik párů megabází, je fragmentována fyzikálními nebo enzymatickými metodami k rozbití dvouvláknových DNA v náhodných intervalech. Bioinformatické mapování sekvenčních čtení je nejúčinnější, když vzorek DNA obsahuje úzký rozsah délek.[7] Pro malé sekvenování RNA, výběr ideální délky fragmentu pro sekvenování se provádí pomocí Gelová elektroforéza;[8] pro sekvenování větších fragmentů jsou fragmenty DNA odděleny výběrem velikosti kuliček.[9]

Připojení sekvencí adaptéru

Sekvence DNA adaptéru musí být připojeny k neznámému fragmentu DNA, aby segmenty DNA se známými sekvencemi lemovaly neznámou DNA. V prvním kole adaptéru ligace, pravý (Ad153_right) a levý (Ad153_left) adaptér jsou připojeny k pravému a levému boku fragmentované DNA a DNA je amplifikována PCR. Dlahová oligonukleotid pak hybridizuje s konci fragmentů, které jsou ligovány za vzniku kruhu. Přidá se exonukleáza k odstranění všech zbývajících lineárních jednořetězcových a dvouřetězcových produktů DNA. Výsledkem je vyplněná kruhová šablona DNA.[2]

Válcování kruhových replikací

Jakmile je vytvořen jednořetězcový kruhový templát DNA, obsahující vzorek DNA, která je ligována do dvou jedinečných sekvencí adaptéru, je celá sekvence amplifikována do dlouhého řetězce DNA. Toho je dosaženo replikace postupného kruhu s Phi 29 DNA polymeráza který váže a replikuje templát DNA. Nově syntetizované vlákno se uvolňuje z kruhové šablony, což vede k dlouhé jednovláknové DNA obsahující několik kopií kruhové šablony od hlavy k patě.[10] Výsledná nanočástice se sama sestaví do těsné koule DNA přibližně 300 nanometry (nm) napříč. Nanobulky zůstávají od sebe odděleny, protože jsou negativně nabité, přirozeně se navzájem odpuzují, čímž se snižuje zamotání mezi různými délkami jednovláknové DNA.[2]

Tvorba DNA nanobulí a adsorpce do vzorované matice flowcell
Tvorba DNA nanobulí a adsorpce do vzorované matice flowcell

DNA nanoball vzorované pole

K získání sekvence DNA jsou nanobulíky DNA připojeny k průtokové kyvetě se vzorovaným polem. Průtočnou celou je křemíková destička potažená oxid křemičitý, titan, hexamethyldisilazan (HMDS) a fotorezist materiál. Nanočástice DNA se přidají do průtokové cely a selektivně se vážou na pozitivně nabitý aminosilan ve vysoce uspořádaném vzoru, což umožňuje sekvenování velmi vysoké hustoty DNA nanobulíků.[2][11]

Zobrazování

Po každém kroku inkorporace nukleotidů DNA se průtoková cela zobrazí, aby se určilo, která nukleotidová báze se váže na nanobulku DNA. Fluorofor je vzrušený s laser který vzrušuje konkrétně vlnové délky světla. Emise fluorescence z každé DNA nanoball je zachycena ve vysokém rozlišení CCD kamera. Obraz je poté zpracován, aby se odstranil šum pozadí a vyhodnotila intenzita každého bodu. Barva každé DNA nanoball odpovídá základně v tázací poloze a počítač zaznamenává informace o poloze základny.[2]

Formát dat sekvenování

Data generovaná z DNA nanoballs jsou formátována jako standard Formátováno FASTQ soubory se sousedícími základnami (bez mezer). Tyto soubory lze použít v jakémkoli kanálu pro analýzu dat, který je nakonfigurován pro čtení souborů FASTQ s jedním nebo spárovaným koncem.

Například:

Přečtěte si 1 ze spárovaného koncového běhu 100 bp z[12]

 @ CL100011513L1C001R013_126365 / 1 CTAGGCAACTATAGGTCTCAGTTAAGTCAAATAAAATTCACATCAAATTTTTACTCCCACCATCCCAACACTTTCCTGCCTGGCATATGCCGTGTCTGCC + FFFFFFFFFFFGFGFFFFFF; FFFFFFFGFGFGFFFFFF; FFFFGFGFGFFEFFFFFEDGFDFF @ FCFGFGCFFFFFEFFEGDFDFFFFFGDAFFEFGFF

Odpovídající čtení 2:

 @ CL100011513L1C001R013_126365 / 2 TGTCTACCATATTCTACATTCCACACTCGGTGAGGGAAGGTAGGCACATAAAGCAATGGCAGTACGGTGTAATACATGCTAATGTAGAGTAAGCACTCAG + 3E9E  9CB & = E <7: - +>; 29: 7 + / 5D9)? 5F /:

Tipy pro informatiku

Zarovnání referenčního genomu

Výchozí parametry pro populární zarovnávače jsou dostatečné.

Číst jména

V souboru FASTQ vytvořeném sekvencery BGI / MGI pomocí nanobulí DNA na flowcelu se vzorkovaným polem vypadají názvy čtení takto:

BGISEQ číst název anatomie
Anatomie čtení BGI sekvenceru
MGISEQ číst název anatomie
Anatomie MGI sekvenceru číst jméno

BGISEQ-500:CL100025298L1C002R050_244547

MGISEQ-2000:V100006430L1C001R018613883

Názvy čtení lze analyzovat a extrahovat tři proměnné popisující fyzické umístění čtení ve vzorovaném poli: (1) dlaždice / oblast, (2) x souřadnice a (3) y souřadnice. Všimněte si, že kvůli pořadí těchto proměnných nelze tyto názvy čtení nativně analyzovat Picarde MarkDuplicates za účelem identifikace optických duplikátů. Jelikož však na této platformě nejsou žádné, nepředstavuje to pro analýzu dat založenou na Picardu žádný problém.

Duplikáty

Vzhledem k tomu, že nanobulice DNA zůstávají omezeny na své skvrny na vzorovaném poli, neexistují žádné optické duplikáty, s nimiž by se dalo zápasit během bioinformatické analýzy sekvenčních čtení. Doporučuje se spustit Picard MarkDuplicates následujícím způsobem:

java -jar picard.jar MarkDuplicates I = input.bam O = označené_duplikáty.bam M = označené_dup_metrics.txt READ_NAME_REGEX = null

Test s přeformátovanými názvy čtení vhodnými pro Picard prokazuje absenci této třídy duplicitních čtení:

Picard Mark Duplicates výsledky testu
Test Picard MarkDuplicates měnící parametr OPTICAL_DUPLICATE_PIXEL_DISTANCE

Jediné čtení označené jako optický duplikát je jistě artefakt. V každém případě je vliv na odhadovanou velikost knihovny zanedbatelný.

Výhody

Technologie sekvenování DNA nanoballů nabízí oproti jiným sekvenčním platformám některé výhody. Jednou z výhod je vymýcení optických duplikátů. Nanobulíčky DNA zůstávají na místě ve vzorovaném poli a neinterferují se sousedními nanobulkami.

Další výhodou sekvenování DNA nanoballů je použití vysoce přesné DNA polymerázy Phi 29[10] aby bylo zajištěno přesné zesílení kruhové šablony, několik stovek kopií kruhové šablony zhuštěné do malé oblasti vedoucí k intenzivnímu signálu a připojení fluoroforu k sondě ve velké vzdálenosti od ligačního bodu vede ke zlepšení ligace.[2]

Nevýhody

Hlavní nevýhodou sekvenování DNA nanobalů je krátká délka čtení sekvencí DNA získaných touto metodou.[2] Krátké čtení, zejména u DNA s vysokým obsahem DNA se opakuje, může mapovat na dvě nebo více oblastí referenčního genomu. Druhou nevýhodou této metody je, že je nutné použít více kol PCR. To může zavést zkreslení PCR a případně zesílit kontaminující látky ve fázi konstrukce templátu.[2] Tyto nevýhody jsou však společné pro všechny platformy pro sekvenování s krátkým čtením, které nejsou specifické pro DNA nanoballs.

Aplikace

V nedávných studiích bylo použito sekvenování DNA nanobalů. Závětří et al. použil tuto technologii k nalezení mutací přítomných u rakoviny plic a porovnal je s normální plicní tkání.[13] Byli schopni identifikovat více než 50 000 jednotlivé nukleotidové varianty. Plotice et al. použili sekvenování DNA nanoball k sekvenování genomů rodiny čtyř příbuzných a byli schopni identifikovat SNP, které mohou být zodpovědné za Mendelianova porucha,[14] a byli schopni odhadnout mezigenerační rychlost mutací.[14] The Ústav pro systémovou biologii použil tuto technologii k sekvenování 615 úplných vzorků lidského genomu jako součást průzkumného studia neurodegenerativní nemoci a Národní onkologický institut používá sekvenování DNA nanobalů k sekvenci 50 nádorů a odpovídajících normálních tkání z dětské rakoviny.[Citace je zapotřebí ]

Význam

Masivně paralelní platformy pro sekvenování nové generace, jako je sekvenování DNA nanobalů, mohou přispět k diagnostice a léčbě mnoha genetických onemocnění. Náklady na sekvenování celého lidského genomu klesly z přibližně jednoho milionu dolarů v roce 2008 na 4400 dolarů v roce 2010 pomocí technologie DNA nanoball.[15] Sekvenování celých genomů pacientů s dědičné choroby nebo rakovina, mutace spojené s těmito chorobami byly identifikovány, otevírají se strategie, jako je cílená terapeutika pro ohrožené lidi a pro genetické poradenství.[15] Vzhledem k tomu, že cena za sekvenování celého lidského genomu se blíží hranici 1 000 $, může být genomové sekvenování každého jedince proveditelné jako součást normálního preventivní medicína.[15]

Reference

  1. ^ Huang, Jie; Liang, Xinming; Xuan, Yuankai; Geng, Chunyu; Li, Yuxiang; Lu, Haorong; Qu, Shoufang; Mei, Xianglin; Chen, Hongbo; Yu, Ting; Sun, Nan; Rao, Junhua; Wang, Jiahao; Zhang, Wenwei; Chen, Ying; Liao, Sha; Jiang, Hui; Liu, Xin; Yang, Zhaopeng; Mu, Feng; Gao, Shangxian (2017). „Soubor referenčních údajů o lidském genomu sekvenátoru BGISEQ-500“. GigaScience. 6 (5): 1–9. doi:10.1093 / gigascience / gix024. ISSN  2047-217X. PMC  5467036. PMID  28379488.
  2. ^ A b C d E F G h i j Drmanac, R .; Sparks, A. B .; Callow, M. J .; Halpern, A. L .; Burns, N.L .; Kermani, B. G .; Carnevali, P .; Nazarenko, I .; et al. (2009). „Sekvenování lidského genomu pomocí neřetězené základny čte na samoobslužných nanopolech DNA“. Věda. 327 (5961): 78–81. Bibcode:2010Sci ... 327 ... 78D. doi:10.1126 / science.1181498. PMID  19892942.
  3. ^ Porreca, Gregory J (2010). "Sekvenování genomu na nanobulkách". Přírodní biotechnologie. 28 (1): 43–4. doi:10.1038 / nbt0110-43. PMID  20062041.
  4. ^ „BGI-Shenzhen dokončuje akvizici kompletní genomiky“. PR Newswire.
  5. ^ „Přehled technologie sekvenování celého genomu Revolocity ™“ (PDF). Kompletní genomika. Citováno 18. listopadu 2017.
  6. ^ Huang, J. (2017). „Soubor referenčních údajů o lidském genomu sekvenátoru BGISEQ-500“. Gigascience. 6 (5): 1–9. doi:10.1093 / gigascience / gix024. PMC  5467036. PMID  28379488.
  7. ^ Fullwood, M. J .; Wei, C.-L .; Liu, E. T .; Ruan, Y. (2009). „Sekvenování DNA příští generace párových koncových značek (PET) pro analýzu transkriptomů a genomu“. Výzkum genomu. 19 (4): 521–32. doi:10.1101 / gr.074906.107. PMC  3807531. PMID  19339662.
  8. ^ Fehlmann, T. (2016). „sekvenování založené na cPAS na BGISEQ-500 k prozkoumání malých nekódujících RNA“. Klinická epigenetika. 8: 123. doi:10.1186 / s13148-016-0287-1. PMC  5117531. PMID  27895807.
  9. ^ Muller, W. (1982). "Frakcionace velikostí fragmentů DNA v rozmezí od 20 do 30000 párů bází pomocí kapaliny / kapalinové chromatografie". Eur J Biochem. 128 (1): 231–238. doi:10.1111 / j.1432-1033.1982.tb06956.x. PMID  7173204.
  10. ^ A b Blanco, Luis; Bernad, Antonio; Lázaro, José M .; Martin, Gil; Garmendia, Cristina; Margarita, M; Salas (1989). „Vysoce účinná syntéza DNA pomocí fágové fí29 DNA polymerázy. Symetrický způsob replikace DNA“. The Journal of Biological Chemistry. 264 (15): 8935–40. PMID  2498321.
  11. ^ Chrisey, L .; Lee, GU; O'Ferrall, CE (1996). „Kovalentní připojení syntetické DNA k samo-sestaveným jednovrstvým filmům“. Výzkum nukleových kyselin. 24 (15): 3031–9. doi:10.1093 / nar / 24.15.3031. PMC  146042. PMID  8760890.
  12. ^ „Aktualizovaný referenční datový soubor lidského genomu sekvenátoru BGISEQ-500“. GigaDB. Citováno 22. března 2017.
  13. ^ Lee, William; Jiang, Zhaoshi; Liu, Jinfeng; Haverty, Peter M .; Guan, Yinghui; Stinson, Jeremy; Yue, Peng; Zhang, Yan; et al. (2010). „Mutační spektrum odhalené spárovanými sekvencemi genomu od pacienta s rakovinou plic“. Příroda. 465 (7297): 473–7. Bibcode:2010Natur.465..473L. doi:10.1038 / nature09004. PMID  20505728.
  14. ^ A b Roach, J. C .; Glusman, G .; Smit, A. F. A .; Huff, C.D .; Hubley, R .; Shannon, P. T .; Rowen, L .; Pant, K. P .; et al. (2010). „Analýza genetické dědičnosti v rodinném kvartetu sekvenováním celého genomu“. Věda. 328 (5978): 636–9. Bibcode:2010Sci ... 328..636R. doi:10.1126 / science.1186802. PMC  3037280. PMID  20220176.
  15. ^ A b C Speicher, Michael R; Geigl, Jochen B; Tomlinson, Ian P (2010). „Účinek asociačních studií v celém genomu, genetické testování přímo spotřebiteli a technologie vysokorychlostního sekvenování na prediktivní genetické poradenství pro riziko rakoviny“. Onkologie lancety. 11 (9): 890–8. doi:10.1016 / S1470-2045 (09) 70359-6. PMID  20537948.