Technologie cyklické sondy - Cycling probe technology

Technologie cyklické sondy (CPT) je a molekulárně biologické technika detekce konkrétních DNA sekvence. CPT pracuje pod izotermický podmínky. V některých aplikacích nabízí CPT alternativu k PCR. Na rozdíl od PCR však CPT negeneruje více kopií samotné cílové DNA a amplifikace signálu je lineární, na rozdíl od exponenciální amplifikace cílové DNA v PCR. CPT používá sekvenčně specifickou chimérickou sondu, která hybridizuje s komplementární cílovou sekvencí DNA a stává se substrátem RNáza H. Štěpení nastává na RNA internukleotidových vazbách a vede k disociaci sondy od cíle, čímž je dostupná pro další molekulu sondy.[1] Integrované elektrokinetické systémy byly vyvinuty pro použití v CPT.[2]

Sonda

Technologie cyklické sondy využívá chimérický sonda nukleové kyseliny detekovat přítomnost konkrétního DNA sekvence. Chimérická sonda se skládá z RNA segment vložený mezi dva segmenty DNA. Segment RNA obsahuje 4 sousedící purin nukleotidy. Sondy by měly mít délku menší než 30 nukleotidů a měly by být navrženy tak, aby se minimalizovaly interakce mezi sondami a mezi sondami.[3]

Proces

Technologie cyklické sondy využívá cyklický, izotermický proces, který začíná na hybridizace chimérické sondy s cílovou DNA. Po hybridizaci se sonda stane vhodným substrátem pro RNáza H. RNase H, an endonukleáza, štěpí RNA část sondy, což vede ke dvěma chimérickým fragmentům. The teplota tání (T.m) nově štěpených fragmentů je nižší než teplota tání původní sondy. Protože reakce CPT je izotermicky udržována těsně nad teplotou tání původní sondy, štěpené fragmenty disociují od cílové DNA. Jakmile je disociována, může cílová DNA volně hybridizovat s novou sondou a znovu zahájit cyklus.[3][4]

Po štěpení a disociaci fragmentů se stanou detekovatelnými. Zahrnuje společnou strategii pro detekci fragmentů fluorescence. U této metody je fluorescenční marker připojen k 5 'konci sondy a zhášeč je připojen k 3 'konci sondy.[4][5] Když RNáza H štěpí sondu, tlumič a fluorescenční marker se oddělí, čímž se zvýší intenzita fluorescenčního markeru. Štěpené fragmenty lze alternativně detekovat pomocí amplifikace (např. PCR ) nebo další úpravy umožňující další chemické prostředky detekce.[6]

Při práci s malými koncentracemi cílové DNA lze protokol CPT upravit, aby se zvýšila specificita a účinnost. Ukázalo se, že zvyšování přiděleného času zlepšuje účinnost štěpení sondy.[4] Ukázalo se, že jak zvýšení koncentrace RNázy H, tak použití sondy, která není náchylná k interakcím mezi sondami a interakcemi uvnitř sondy, zvyšují specificitu.[3]

Výhody

Protože technologie cyklické sondy nezahrnuje amplifikaci cílové DNA, CPT má nižší riziko křížová kontaminace než PCR.[3][4] CPT je navíc rychlejší než PCR[4] a nevyžaduje odborníka termocykler. CPT také nevyžaduje spouštění produktů CPT na a gel.

Nevýhody

CPT vyžaduje specializované chimérické sondy, takže testy CPT jsou dražší než PCR.[5] Protože sondy CPT jsou tak specifické, musí být pro každou jedinečnou analýzu navržena nová sonda, což dále zvyšuje náklady. Klinická implementace je finančně omezena, ale je také omezena možností vzorků obsahujících nespecifické vzorky RNázy jiné než RNase H.[3]

Aplikace

CPT lze použít k detekci specifických sekvencí DNA a specifických pro rozšíření genotypy. Například CPT lze použít k rozlišení GMO vyrábět z produktů bez GMO.[5] Klinicky lze CPT použít jako alternativu k buněčné kultivaci za účelem detekce antibakteriální odolnost patogenu.[4]

CPT ve svém jádru detekuje, zda je ve vzorku přítomna specifická sekvence. Ale protože se štěpené sondy hromadí kinetika lineární rychlosti lze kvantifikovat množství cílové DNA. V důsledku toho se CPT používá ke kvantifikaci počtu nekódujících opakování v organismech.[3]

CPT lze použít ve spojení s jinými technologiemi, jako je molekulární majáky a qPCR.[7]

Reference

  1. ^ Bhatt R, Scott B, Whitney S, Bryan RN, Cloney L, Lebedev A (1999). „Detekce nukleových kyselin pomocí cyklické sondy na magnetických částicích: vysoká citlivost a snadná separace“. Nukleosidy a nukleotidy. 18 (6–7): 1297–9. doi:10.1080/07328319908044696. PMID  10474219.
  2. ^ Tang T, Badal MY, Ocvirk G, Lee WE, Bader DE, Bekkaoui F, Harrison DJ (únor 2002). "Integrovaný systém mikrofluidní elektroforézy pro analýzu genetických materiálů pomocí metod zesílení signálu". Analytická chemie. 74 (4): 725–33. doi:10.1021 / ac010874j. PMID  11866051.
  3. ^ A b C d E F Beggs ML, Cave MD, Marlowe C, Cloney L, Duck P, Eisenach KD (prosinec 1996). „Charakterizace přímé opakovací sekvence komplexu Mycobacterium tuberculosis pro použití při reakci cyklické sondy“. Journal of Clinical Microbiology. 34 (12): 2985–9. doi:10.1128 / JCM.34.12.2985-2989.1996. PMC  229446. PMID  8940435.
  4. ^ A b C d E F Fong WK, Modrusan Z, McNevin JP, Marostenmaki J, Zin B, Bekkaoui F (červenec 2000). „Rychlý imunotest v pevné fázi pro detekci methicilin-rezistentního Staphylococcus aureus pomocí technologie cyklické sondy“. Journal of Clinical Microbiology. 38 (7): 2525–9. doi:10.1128 / JCM.38.7.2525-2529.2000. PMC  86959. PMID  10878037.
  5. ^ A b C Buh Gasparic M, Cankar K, Zel J, Gruden K (březen 2008). „Srovnání různých chemických reakcí v reálném čase a jejich vhodnosti pro detekci a kvantifikaci geneticky modifikovaných organismů“. BMC biotechnologie. 8: 26. doi:10.1186/1472-6750-8-26. PMC  2322970. PMID  18325084.
  6. ^ Wolcott MJ (říjen 1992). „Pokroky v metodách detekce na bázi nukleových kyselin“. Recenze klinické mikrobiologie. 5 (4): 370–86. doi:10.1128 / cmr. 5.4.370. PMC  358255. PMID  1423216.
  7. ^ Jacroux T, Rieck DC, Cui R, Ouyang Y, Dong WJ (leden 2013). "Enzymatická amplifikace hybridní molekulární signalizace DNA / RNA při detekci nukleových kyselin". Analytická biochemie. 432 (2): 106–14. doi:10.1016 / j.ab.2012.09.015. PMC  3522425. PMID  23000602.