Normalizace Western blot - Western blot normalization

Normalizace z Western blot data jsou analytickým krokem, který se provádí k porovnání relativní hojnosti konkrétního protein přes pruhy skvrny nebo gel v rámci různých experimentálních ošetření nebo napříč tkáněmi nebo vývojovými stadii.[1][2] Celkovým cílem normalizace je minimalizovat účinky vyplývající z odchylek v experimentálních chybách, jako je nekonzistentní příprava vzorku, nerovnoměrné zatížení vzorku napříč gelovými pruhy nebo nerovnoměrný přenos proteinu, což může ohrozit závěry, které lze získat z Western blot data.[1] V současné době existují dvě metody normalizace Western blot údaje: (i) normalizace proteinu v domácnosti a (ii) normalizace celkového proteinu.[1][2][3][4]

Postup

K normalizaci dochází přímo na gelu nebo blotovací membráně. Nejprve se zobrazí obarvený gel nebo skvrna, kolem cílového proteinu se v každé dráze nakreslí obdélník a změří se intenzita signálu uvnitř obdélníku.[1] Získaná intenzita signálu může být poté normalizována s ohledem na intenzitu signálu zaváděcí vnitřní kontroly detekovanou na stejném gelu nebo blotu.[1] Při použití proteinových barviv může být membrána inkubována s vybraným barvivem před nebo po imunodetekci, v závislosti na typu barvení.[5]

Kontrola proteinů v domácnosti

Geny pro úklid a proteiny, včetně β-aktin, GAPDH, HPRT1, a RPLP1, se často používají jako interní kontroly v západní bloty protože se předpokládá, že jsou vyjádřeny konstitutivně na stejné úrovni napříč experimenty.[1][2][6][7] Nedávné studie však ukázaly, že exprese domácích proteinů (HKP) se může měnit v různých typech buněk a biologických podmínkách.[1][8][9][10] Vědečtí vydavatelé a finanční agentury proto nyní vyžadují, aby byly u každého experimentu předem ověřeny normalizační kontroly, aby byla zajištěna reprodukovatelnost a přesnost výsledků.[8][9][10]

Fluorescenční protilátky

Při použití fluorescenčních protilátek k zobrazení proteinů ve westernovém přenosu vyžaduje normalizace, aby uživatel definoval horní a dolní mez kvantifikace a charakterizoval lineární vztah mezi intenzitou signálu a objemem vzorku pro každý antigen.[1] Cílový protein i normalizační kontrola musí fluoreskovat v dynamickém rozsahu detekce.[1] Mnoho HKP je exprimováno ve vysokých hladinách a je výhodné pro použití s ​​vysoce exprimovanými cílovými proteiny.[1] Při stejném blotu je obtížné detekovat proteiny s nižší expresí.[1]

Fluorescenční protilátky jsou komerčně dostupné a pro zajištění konzistence výsledků se doporučují plně charakterizované protilátky.[11][12][13]

Pokud se fluorescenční detekce nepoužívá, musí se kontrolní protein nanášení a sledovaný protein značně lišit molekulární váha takže jsou pro přesnou analýzu adekvátně odděleny gelovou elektroforézou.[1]

Odizolování membrány

Při detekci více proteinových cílů na stejném skvrně je třeba stripovat a znovu sondovat novou sadu detekčních protilátek.[6] Neúčinné stripování by mohlo mít za následek slabý signál z cílového proteinu.[6] Aby se zabránilo ztrátě antigenu, doporučují se na membránu pouze tři stripovací inkubace.[6] Mohlo by být obtížné zcela eliminovat signál z vysoce hojných proteinů, proto se doporučuje nejprve detekovat proteiny s nízkou expresí.[6]

Exogenní spike-in kontroly

Vzhledem k tomu, že hladiny HKP mohou být mezi tkáněmi nekonzistentní, mohou vědci kontrolovat sledovaný protein tak, že se v čisté, exogenní protein známé koncentrace v lineárním rozmezí protilátky.[8][9][10] Ve srovnání s HKP je k dispozici širší paleta proteinů pro kontroly špice.[14]

Celková normalizace bílkovin

Při celkové normalizaci proteinu (TPN) se množství cílového proteinu normalizuje na celkové množství proteinu v každé dráze.[3][4] Protože TPN nezávisí na jediném ovládacím prvku načítání, není nutné ověřování ovládacích prvků a odstraňování / opětovné testování blotů pro detekci HKP.[6][15] To může zlepšit přesnost (až 0,1 μg celkového proteinu na dráhu), nákladovou efektivitu a spolehlivost dat.[16]

Fluorescenční skvrny a gely bez skvrn vyžadují speciální vybavení pro vizualizaci proteinů na gelu / skvrně.[5] Skvrny nemusí pokrýt skvrnu rovnoměrně; směrem k okrajům skvrny se může hromadit více skvrn než ve středu. Nerovnoměrnost obrazu může vést k nepřesné normalizaci.[1]

Skvrny před protilátkou

Aniontová barviva jako např Ponceau S a Coomassie Brilliant Blue a fluorescenční barviva jako Sypro Ruby a Deep Purple se používají před přidáním protilátek, protože neovlivňují imumunodetekci po proudu.[17][18][19][20]

Ponceau S je záporně nabité reverzibilní barvivo, které obarví bílkoviny načervenalou barvou a snadno se odstraní promytím vodou.[21][22] Intenzita barvení Ponceau S v průběhu času rychle klesá, takže dokumentace by měla být provedena rychle.[5] U Ponceau S se uvádí lineární rozsah až 140 µg se špatnou reprodukovatelností díky jeho vysoce časově závislé intenzitě barvení a nízkému poměru signálu k šumu.[21][22]

Fluorescenční barviva jako Sypro Ruby mají široký lineární rozsah a jsou citlivější než aniontová barviva.[22] Jsou to trvalé, fotostabilní skvrny, které lze vizualizovat pomocí standardního transiluminátoru UV nebo modrého světla nebo laserového skenování.[1][22] Membrány lze poté dokumentovat buď na filmu, nebo digitálně pomocí a CCD Fotoaparát.[23] Barvení Sypro Ruby blot je časově náročné a má sklon k nasycení nad 50 μg proteinu na dráhu.[22]

Skvrny po protilátkách

Amido černá je běžně používané permanentní aniontové barvivo po protilátce, které je citlivější než Ponceau S.[24] Tato skvrna se nanáší po imumunodetekci.[24]

Technologie bez skvrn

Technologie bez skvrn využívá pro zobrazování chemii v gelu.[22][25][26] Tato chemická reakce neovlivňuje přenos proteinů ani navazující vazbu protilátek.[27] Také to nezahrnuje kroky barvení / odbarvování a intenzita pásů zůstává v průběhu času konstantní.[28]

Technologie bez skvrn nedokáže detekovat bílkoviny, které neobsahují tryptofan zbytky. K povolení detekce jsou zapotřebí minimálně dva tryptofany.[5] Lineární rozsah pro normalizaci bez skvrn je až 80 ug proteinu na dráhu pro 18 jamek a až 100 µg na dráhu pro 12jamkové gely Criterion střední velikosti. Tento rozsah je kompatibilní s typickými proteinovými zátěžemi v kvantitativních Western blotech a umožňuje výpočty řízení zátěže v širokém rozmezí zátěže bílkovinami.[29][4] Nedávno byla také k dispozici účinnější metoda bez skvrn.[30][31] Při použití vysokého obsahu bílkovin prokázala technologie bez skvrn větší úspěch než skvrny.[29]

Reference

  1. ^ A b C d E F G h i j k l m n Taylor, SC; Berkelman, T; Yadav, G; Hammond, M (2016-08-23). „Definovaná metodika pro spolehlivou kvantifikaci dat Western blotu“. Mol. Biotechnol. 55 (3): 217–26. doi:10.1007 / s12033-013-9672-6. PMC  3840294. PMID  23709336.
  2. ^ A b C Thellin, O .; Zorzi, W .; Lakaye, B .; De Borman, B .; Coumans, B .; Hennen, G .; Grisar, T .; Igout, A .; Heinen, E. (08.10.1999). „Geny pro domácnost jako vnitřní standardy: použití a limity“. Journal of Biotechnology. 75 (2–3): 291–295. doi:10.1016 / s0168-1656 (99) 00163-7. ISSN  0168-1656. PMID  10617337.
  3. ^ A b Aldridge, Georgina M .; Podrebarac, David M .; Greenough, William T .; Weiler, Ivan Jeanne (30. 7. 2008). „Použití celkových proteinových skvrn jako kontroly plnění: Alternativa k vysoce hojným kontrolám s jedním proteinem v semikvantitativním imunoblotu“. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2): 250–254. doi:10.1016 / j.jneumeth.2008.05.003. PMC  2567873. PMID  18571732.
  4. ^ A b C Collins, Mahlon A .; An, Jiyan; Peller, Danielle; Bowser, Robert (2015-08-15). „Celkový protein je účinnou kontrolou zátěže pro western bloty mozkomíšního moku“. Journal of Neuroscience Methods. 251: 72–82. doi:10.1016 / j.jneumeth.2015.05.011. PMC  4540354. PMID  26004848.
  5. ^ A b C d „Celková normalizace bílkovin pro Western Blot - Advansta Inc“. 2014-11-05. Citováno 2016-10-01.
  6. ^ A b C d E F Bass, J. J .; Wilkinson, D. J .; Rankin, D .; Phillips, B. E .; Szewczyk, N.J .; Smith, K .; Atherton, P. J. (06.06.2016). „Přehled technických hledisek pro aplikace Western blot pro fyziologický výzkum“. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1): 4–25. doi:10.1111 / sms.12702. ISSN  1600-0838. PMC  5138151. PMID  27263489.
  7. ^ Li, Rena; Shen, Yong (2013-04-19). „Stará metoda čelící nové výzvě: opětovná návštěva domácích proteinů jako interní referenční kontroly pro neurovědecký výzkum“. Humanitní vědy. 92 (13): 747–751. doi:10.1016 / j.lfs.2013.02.014. ISSN  1879-0631. PMC  3614345. PMID  23454168.
  8. ^ A b C Zhu, Jiang; On, Fuhong; Song, Shuhui; Wang, Jing; Yu, červen (01.01.2008). „Kolik lidských genů lze definovat jako úklid s aktuálními údaji o expresi?“. BMC Genomics. 9: 172. doi:10.1186/1471-2164-9-172. ISSN  1471-2164. PMC  2396180. PMID  18416810.
  9. ^ A b C Barber, Robert D .; Harmer, Dan W .; Coleman, Robert A .; Clark, Brian J. (2005-05-11). „GAPDH jako udržovací gen: analýza exprese mRNA GAPDH v panelu 72 lidských tkání“. Fyziologická genomika. 21 (3): 389–395. CiteSeerX  10.1.1.459.7039. doi:10.1152 / fyziolgenomika.00025.2005. ISSN  1094-8341. PMID  15769908.
  10. ^ A b C Lee, Peter D .; Sládek, Robert; Greenwood, Celia M. T .; Hudson, Thomas J. (2002-02-01). „Kontrolní geny a variabilita: absence všudypřítomných referenčních transkriptů v různých studiích exprese savců“. Výzkum genomu. 12 (2): 292–297. doi:10,1101 / gr. 217802. ISSN  1088-9051. PMC  155273. PMID  11827948.
  11. ^ Couchman, John R. (01.10.2016). „Komerční protilátky: dobré, špatné a opravdu ošklivé“. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (1): 7–8. doi:10.1369 / jhc.2008.952820. ISSN  0022-1554. PMC  2605718. PMID  18854593.
  12. ^ Gilda, Jennifer E .; Ghosh, Rajeshwary; Cheah, Jenice X .; West, Toni M .; Bodine, Sue C .; Gomes, Aldrin V. (2015-08-19). „Nepřesnosti Western Blotting s neověřenými protilátkami: potřeba standardu Western Blotting Minimal Reporting Standard (WBMRS)“. PLOS ONE. 10 (8): e0135392. doi:10.1371 / journal.pone.0135392. ISSN  1932-6203. PMC  4545415. PMID  26287535.
  13. ^ „Ověření protilátek: naléhavá potřeba | The Scientist Magazine®“. Vědec. Citováno 2016-10-01.
  14. ^ „6 změn, díky nimž bude váš RNA-seq velký rozdíl; Část 3 - Genomika kofaktorů“. cofactorgenomics.com. Citováno 2016-10-01.
  15. ^ Fosang, Amanda J .; Colbran, Roger J. (11. 12. 2015). „Transparentnost je klíčem ke kvalitě“. The Journal of Biological Chemistry. 290 (50): 29692–29694. doi:10,1074 / jbc.E115.000002. ISSN  0021-9258. PMC  4705984. PMID  26657753.
  16. ^ Moritz, CP. (2017-09-20). „Tubulin nebo ne tubulin: Směřujeme k barvení celkových bílkovin jako kontrola nakládání ve Western blotech“ (PDF). Proteomika. 17 (20): 1600189. doi:10.1002 / pmic.201600189. PMID  28941183.
  17. ^ Welinder, Charlotte; Ekblad, Lars (04.03.2011). "Coomassie Staining as Loading Control in Western Blot Analysis". Journal of Proteome Research. 10 (3): 1416–1419. doi:10.1021 / pr1011476. ISSN  1535-3893. PMID  21186791.
  18. ^ Ranganathan, Velvizhi; De, Prabir K. (01.02.1996). „Western Blot of Proteins from Coomassie-Stained Polyacrylamide Gels“. Analytická biochemie. 234 (1): 102–104. doi:10.1006 / abio.1996.0057. PMID  8742090.
  19. ^ Steinberger, B (2015-05-01). „Hodnocení barviva SYPRO Ruby total protein pro normalizaci dvourozměrných Western blotů“. Analytická biochemie. 476 (1): 17–19. doi:10.1016 / j.ab.2015.01.015. PMID  25640586.
  20. ^ „Celková normalizace bílkovin pro Western Blot - Advansta Inc“. Citováno 2016-10-01.
  21. ^ A b Rivero-Gutiérrez, B .; Anzola, A .; Martínez-Augustin, O .; de Medina, F. Sánchez (15. 12. 2014). „Detekce bez skvrn jako alternativa kontroly nakládání s Ponceau a imunodetekce proteinů v domácnosti při Western blotu“. Analytická biochemie. 467: 1–3. doi:10.1016 / j.ab.2014.08.027. ISSN  1096-0309. PMID  25193447.
  22. ^ A b C d E F Gürtler, Anne; Kunz, Nancy; Gomolka, Maria; Hornhardt, Sabine; Friedl, Anna A .; McDonald, Kevin; Kohn, Jonathan E .; Posch, Anton (2013-02-15). „Technologie Stain-Free jako normalizační nástroj v analýze Western blot“. Analytická biochemie. 433 (2): 105–111. doi:10.1016 / j.ab.2012.10.010. PMID  23085117.
  23. ^ „Fluorescenční zobrazování: principy a metody“ (PDF). Citováno 10. ledna 2018.
  24. ^ A b Goldman, A; Harper, S; Speicher, DW (01.11.2016). Detekce proteinů na blotových membránách. Současné protokoly ve vědě o bílkovinách. 86. str. 10.8.1–10.8.11. doi:10,1002 / cpps.15. ISBN  9780471140863. PMC  5646381. PMID  27801518.
  25. ^ Zeitler, Anna F .; Gerrer, Katrin H .; Haas, Rainer; Jiménez-Soto, Luisa F. (01.07.2016). "Optimalizovaná semikvantitativní analýza blotů v testech na infekci pomocí technologie Stain-Free". Časopis mikrobiologických metod. 126: 38–41. doi:10.1016 / j.mimet.2016.04.016. PMID  27150675.
  26. ^ "Technologie bez skvrn | Aplikace a technologie | Bio-Rad". www.bio-rad.com. Citováno 2016-10-01.
  27. ^ Colella, Alex D .; Chegenii, Nusha; Tea, Melinda N .; Gibbins, Ian L .; Williams, Keryn A.; Chataway, Tim K. (15. listopadu 2012). "Srovnání gelů bez skvrn s tradiční metodou řízení načítání imunoblotem". Analytická biochemie. 430 (2): 108–110. doi:10.1016 / j.ab.2012.08.015. PMID  22929699.
  28. ^ Gilda, Jennifer E .; Gomes, Aldrin V. (2013-09-15). „Barvení celkových bílkovin bez skvrn je lepší kontrola nakládání s β-aktinem pro Western bloty“. Analytická biochemie. 440 (2): 186–188. doi:10.1016 / j.ab.2013.05.027. PMC  3809032. PMID  23747530.
  29. ^ A b Simonyi, K. & Yadav, G. (7. srpna 2016). „Trendy v kvantitativním Western blotu - vznik celkové normalizace proteinů“. Bioscience Technology. Výhodné médium.
  30. ^ "Skvrnitý přístup pro Western Blot | Články časopisu GEN | GEN". GEN. Citováno 2016-10-01.
  31. ^ Gilda, JenniferE .; Gomes, Aldrin V. (01.01.2015). Posch, Anton (ed.). Proteomické profilování. Metody v molekulární biologii. 1295. Springer New York. 381–391. doi:10.1007/978-1-4939-2550-6_27. ISBN  9781493925490. PMID  25820735.

externí odkazy