Syntetické genomy - Synthetic genomes

Syntetický genom je synteticky vytvořený genom, jehož tvorba zahrnuje buď genetická úprava o již existujících formách života nebo umělá genová syntéza k vytvoření nové DNA nebo celých forem života.[1][2][3]. Pole, které studuje syntetické genomy, se nazývá Syntetická genomika.

Technologie rekombinantní DNA

Brzy po objevu restrikční endonukleázy a ligázy, pole genetiky začalo používat tyto molekulární nástroje k sestavování umělých sekvencí z menších fragmentů syntetických nebo přirozeně se vyskytujících DNA. Výhoda v použití rekombinačního přístupu oproti kontinuálnímu Syntéza DNA vychází z inverzního vztahu, který existuje mezi délkou syntetické DNA a procentní čistotou této syntetické délky. Jinými slovy, jak syntetizujete delší sekvence, zvyšuje se počet klonů obsahujících chyby kvůli inherentní chybovosti současných technologií.[4] Ačkoli rekombinantní DNA technologie se běžněji používá při stavbě fúzní proteiny a plazmidy, se objevilo několik technik s většími kapacitami, které umožňují konstrukci celých genomů.[5]

Sestava pro cyklickou polymerázu

Sestava pro cyklickou polymerázu. Modré šipky představují oligonukleotidy 40 až 60 bp s překrývajícími se oblastmi asi 20 bp. Cyklus se opakuje, dokud není vytvořen konečný genom.

Polymerázová cyklistická sestava (PCA) používá řadu oligonukleotidů (nebo oligonukleotidů) o délce přibližně 40 až 60 nukleotidů, které dohromady tvoří oba řetězce syntetizované DNA. Tato oliga jsou navržena tak, že jediné oligo z jednoho řetězce obsahuje na každém konci délku přibližně 20 nukleotidů, která je komplementární se sekvencemi dvou různých oligonukleotidů na opačném řetězci, čímž vytváří oblasti překrytí. Celá sada je zpracována v cyklech: (a) hybridizace při 60 ° C; (b) prodloužení prostřednictvím Taq polymeráza a standardní ligáza; a (c) denaturace při 95 ° C, vytváření postupně delších souvislých řetězců a nakonec vedoucí k finálnímu genomu.[6] PCA byl použit ke generování prvního syntetického genomu v historii, genomu Virus Phi X 174.[7]

Gibsonův způsob montáže

Gibsonův způsob montáže. Modré šipky představují kazety DNA, které mohou mít libovolnou velikost, například 6 kb. Oranžové segmenty představují oblasti identických sekvencí DNA. Tento proces lze provést pomocí několika počátečních kazet.

The Gibsonův způsob montáže, navržený Danielem Gibsonem během jeho působení v Institut J. Craiga Ventera, vyžaduje sadu dvouřetězcových DNA kazet, které tvoří celý syntetizovaný genom. Všimněte si, že kazety se liší od kontig podle definice v tom, že tyto sekvence obsahují oblasti homologie s jinými kazetami pro účely rekombinace. Na rozdíl od Polymerase Cycling Assembly je Gibson Assembly jednokroková, izotermická reakce s větší kapacitou sekvenční délky; ergo, používá se místo Polymerase Cycling Assembly pro genomy větší než 6 kb.

V 5 exonukleáza provádí žvýkací reakci v koncových segmentech, pracuje ve směru 5 'až 3', čímž vytváří doplňkové převisy. Převisy navzájem hybridizují, Fúze DNA polymeráza vyplní všechny chybějící nukleotidy a zářezy jsou utěsněny ligázou. Samotné genomy, které lze syntetizovat pouze touto metodou, jsou však omezené, protože se zvětšováním délky kazet DNA je pro pokračování hybridizace nutná propagace in vitro; podle toho se Gibsonova sestava často používá ve spojení s Transformation-Associated Recombination (viz níže) k syntéze genomů o velikosti několika stovek kilobází.[8]

Rekombinace spojená s transformací

Oprava klonování mezery. Modré šipky představují DNA kontigy. Segmenty stejné barvy představují doplňkové nebo identické sekvence. Specializované primery s prodloužením se používají při polymerázové řetězové reakci ke generování oblastí homologie na koncových koncích DNA kontig.

Cílem technologie TAR (Transformation-Associated Recombination) v syntetické genomice je kombinovat DNA řetězce pomocí homologní rekombinace provádí Umělý chromozom kvasinek (YAC). Důležitý je prvek CEN v rámci YAC vektor, což odpovídá kvasinkové centromere. Tato sekvence dává vektoru schopnost chovat se chromozomálně, což mu umožňuje vykonávat homologní rekombinace.[9]

Rekombinace spojená s transformací. K událostem křížení dochází mezi oblastmi homologie napříč kazetami a YAC vektorem, čímž se spojují menší sekvence DNA do jedné větší kontigy.

Nejprve se provede klonování opravy mezer, aby se vytvořily oblasti homologie obklopující DNA kontigy. Klonování opravy mezer je zvláštní formou Polymerázová řetězová reakce na které se specializuje primery s prodloužením za sekvenci cíle DNA.[10] Poté jsou kazety DNA vystaveny vektoru YAC, který řídí proces homologní rekombinace, čímž dochází k propojení kazet DNA. Polymerase Cycling Assembly a technologie TAR byly použity společně ke konstrukci 600 kb Mycoplasma genitalium genom v roce 2008, první syntetický organismus, jaký byl kdy vytvořen.[11] Podobné kroky byly podniknuty při syntéze větších Mycoplasma mycoides genom o několik let později.[12]

Viz také

Reference

  1. ^ Yong, vyd. „Tajemná věc o úžasné nové syntetické buňce“. Atlantik. Citováno 2017-09-12.
  2. ^ „Tady je to, co bychom se opravdu mohli naučit ze syntetického lidského genomu“. STAT. 2016-06-02. Citováno 2017-09-12.
  3. ^ „Syntetický lidský genom by mohl být za rohem - ExtremeTech“. ExtremeTech. 2016-05-19. Citováno 2017-09-12.
  4. ^ Montague, Michael G; Lartigue, Carole; Vashee, Sanjay (2012). "Syntetická genomika: potenciál a omezení". Aktuální názor na biotechnologie. 23 (5): 659–665. doi:10.1016 / j.copbio.2012.01.014. PMID  22342755.
  5. ^ Gibson, Daniel (2011). Syntetická biologie, část B: Počítačem podporovaný design a montáž DNA; Kapitola patnáctá - Enzymatické shromáždění překrývajících se fragmentů DNA. Akademický tisk. str. 349–361. ISBN  978-0-12-385120-8.
  6. ^ Stemmer, Willem P. C .; Crameri, Andreas; Ha, Kim D .; Brennan, Thomas M .; Heyneker, Herbert L. (1995-10-16). "Jednostupňové sestavení genu a celého plazmidu z velkého počtu oligodeoxyribonukleotidů". Gen. 164 (1): 49–53. doi:10.1016/0378-1119(95)00511-4. PMID  7590320.
  7. ^ Smith, Hamilton O .; Hutchison, Clyde A .; Pfannkoch, Cynthia; Venter, J. Craig (2003-12-23). „Generování syntetického genomu sestavením celého genomu: bakteriofág φX174 ze syntetických oligonukleotidů“. Sborník Národní akademie věd. 100 (26): 15440–15445. doi:10.1073 / pnas.2237126100. ISSN  0027-8424. PMC  307586. PMID  14657399.
  8. ^ Gibson, Daniel G; Young, Lei; Chuang, Ray-Yuan; Venter, J Craig; Hutchison, Clyde A; Smith, Hamilton O (2009-04-12). "Enzymatické sestavení molekul DNA až do několika set kilobází". Přírodní metody. 6 (5): 343–345. doi:10.1038 / nmeth.1318. PMID  19363495.
  9. ^ Kouprina, Natalay; Larionov, Vladimir (01.12.2003). „Využití kvasinek Saccharomyces cerevisiae pro studium organizace a vývoje komplexních genomů“. Recenze mikrobiologie FEMS. 27 (5): 629–649. doi:10.1016 / S0168-6445 (03) 00070-6. ISSN  1574-6976. PMID  14638416.
  10. ^ Marsischky, Gerald; LaBaer, ​​Joshua (2004-10-15). „Mnoho cest k mnoha klonům: Srovnávací pohled na vysoce výkonné metody klonování“. Výzkum genomu. 14 (10b): 2020–2028. doi:10,1101 / gr. 2528804. ISSN  1088-9051. PMID  15489321.
  11. ^ Gibson, Daniel G .; Benders, Gwynedd A .; Andrews-Pfannkoch, Cynthia; Denisova, Evgeniya A .; Baden-Tillson, Holly; Zaveri, Jayshree; Stockwell, Timothy B .; Brownley, Anushka; Thomas, David W. (2008-02-29). "Kompletní chemická syntéza, shromáždění a klonování genomu Mycoplasma genitalium". Věda. 319 (5867): 1215–1220. doi:10.1126 / science.1151721. ISSN  0036-8075. PMID  18218864.
  12. ^ Gibson, Daniel G .; Glass, John I .; Lartigue, Carole; Noskov, Vladimir N .; Chuang, Ray-Yuan; Algire, Mikkel A .; Benders, Gwynedd A .; Montague, Michael G .; Ma, Li (02.07.2010). „Vytvoření bakteriální buňky řízené chemicky syntetizovaným genomem“. Věda. 329 (5987): 52–56. doi:10.1126 / science.1190719. ISSN  0036-8075. PMID  20488990.