Webově zaměřené označení rotací - Site-directed spin labeling

Webově zaměřené označení rotací (SDSL) je technika pro zkoumání struktury a lokální dynamiky bílkoviny použitím elektronová spinová rezonance. Teorie SDSL je založena na specifické reakci točit štítky s aminokyseliny. Integrovanou proteinovou strukturu spinového štítku lze detekovat pomocí EPR spektroskopie. SDSL je také užitečným nástrojem při vyšetřování skládání bílkovin proces.[1]

Označení odstřeďování

EPR spektrum proxyl-MTS odstředěné kvasnice iso-1-cytochrom C. Otáčejte štítek je připojen k Cystein 102 zbytků.

Značení spinů zaměřené na místo (SDSL) bylo propagováno v laboratoři v Dr. W.L. Hubbell.[2][3] V SDSL jsou místa pro připojení spinových značek zavedena do rekombinantně exprimovaných proteinů pomocí místně zaměřená mutageneze. Funkční skupiny obsažené ve spinovém štítku určují jejich specificitu. Při neutrálním pH proteinové thiolové skupiny specificky reagují s funkčními skupinami methanethiosulfonátem, maleimidem a jodacetamidem a vytvářejí kovalentní vazbu s aminokyselinou Cys.[4] Spin štítky jsou jedinečným molekulárním reportérem v tom, že jsou paramagnetické (obsahují nepárový elektron). Spin štítky byly nejprve syntetizovány v laboratoři H. M. McConnell v roce 1965.[5] Od té doby různé nitroxidy točit štítky se těší širokému použití pro studium makromolekulární struktury a dynamiky díky své stabilitě a jednoduchosti EPR signál. Nitroxylový radikál (N-O) je obvykle začleněn do heterocyklického kruhu (např. pyrrolidin ) a nepárový elektron je převážně lokalizován do vazby N-O. Po začlenění do proteinu jsou pohyby spinového štítku diktovány místním prostředím. Vzhledem k tomu, že štítky spin jsou mimořádně citlivé na pohyb, má to zásadní vliv na jeho spektrum EPR.[4][6]

Sestavování komplexů membránových proteinů s více podjednotkami bylo také studováno pomocí spinového značení. Vazba podjednotky PsaC na podjednotky PsaA a PsaB fotosyntetického reakčního centra Photosystem I byla pomocí této techniky analyzována velmi podrobně.[7]

Skupina Dr. Ralfa Langena ukázala, že SDSL s EPR (University of Southern California, Los Angeles) lze použít k pochopení struktury amyloidních fibril a struktury membránově vázaného proteinu alfa-synukleinu na Parkinsonovu chorobu.[8] Studie z roku 2012 vygenerovala strukturu IAPP fibril s vysokým rozlišením pomocí kombinace SDSL, pulzní EPR a výpočetní biologie.[9]

Reference

  1. ^ Oda, Michael N (2003). „C-koncová doména apolipoproteinu A-I obsahuje konformační spouštěč citlivý na lipidy“. Přírodní strukturní a molekulární biologie. 10 (6): 455–60. doi:10.1038 / nsb931. PMID  12754494. S2CID  25438936.
  2. ^ Altenbach, C .; Flitsch, S.L .; Khorana, H.G .; Hubbell, W.L. (1989). „Strukturální studie na transmembránových proteinech. 2. Spinové značení bakteriorhodopsinových mutantů na jedinečné cysteiny“. Biochemie. 28 (19): 7806–7812. doi:10.1021 / bi00445a042. PMID  2558712.
  3. ^ Altenbach, C .; Marti, T .; Khorana, H.G .; Hubbell, W.L. (1990). "Struktura transmembránových proteinů: Spinové značení bakteriorhodopsinových mutantů". Věda. 248 (4959): 1088–192. Bibcode:1990Sci ... 248.1088A. doi:10.1126 / science.2160734. PMID  2160734.
  4. ^ A b Klare, J.P .; Steinhoff, H.-J. (2009). "Spin Labeling EPR". Fotosyntetický výzkum. 102 (2–3): 377–390. doi:10.1007 / s11120-009-9490-7. PMID  19728138. S2CID  40673871.
  5. ^ Stone, T. J.; Buckman, T .; Nordio, P.L .; McConnell, H.M. (1965). „Spinem značené biomolekuly“. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 54 (4): 1010–1017. Bibcode:1965PNAS ... 54.1010S. doi:10.1073 / pnas.54.4.1010. PMC  219782. PMID  5219813.
  6. ^ Bordignon, E .; Steinhoff, H.-J. (2007). "Struktura a dynamika membránových proteinů studována místně řízeným spinovým značením ESR". In Biologická magnetická rezonance 27 - ESR spektroskopie v membránové biofyzice. Biologická magnetická rezonance. 27: 129–164. doi:10.1007/978-0-387-49367-1_5. ISBN  978-0-387-25066-3.
  7. ^ Jagannathan, B; Dekat, S; Golbeck, JH; Lakshmi, KV (2010). „Sestavení vícepodjednotkového fotosyntetického komplexu membránových proteinů: Site-specific Spin Labeling Spectroscopic Study of the PsaC Subunit in Photosystem I“. Biochemie. 49 (11): 2398–2408. doi:10.1021 / bi901483f. PMID  20158221.
  8. ^ Chen, M .; Margittai, M .; Chen, J .; Langen, R. (2007). „Vyšetřování struktury alfa-synukleinových vláken pomocí místně orientovaného označování spinů“. J. Biol. Chem. 282 (34): 24970–24979. doi:10,1074 / jbc.M700368200. PMID  17573347.
  9. ^ Bedrood, Sahar; Yiyu Li; J. Mario Isas; Balachandra G. Hegde; Ulrich Baxa; Ian S. Haworth; Ralf Langen (únor 2012). "Struktura vláken lidského ostrůvku amyloidového polypeptidu". J. Biol. Chem. 287 (8): 5235–41. doi:10.1074 / jbc.M111.327817. PMC  3285303. PMID  22187437.