Přepis run-off - Run-off transcription

A přepis run-off assay je test v molekulární biologie který se provádí in vitro identifikovat polohu startovacího místa transkripce (1 pár bází proti proudu) konkrétního promotoru spolu s jeho přesností a rychlostí in vitro transkripce.[1][2][3]

Run-off transkripce může být použita ke kvantitativnímu měření účinku změny promotorových oblastí na transkripční hladiny in vitro,[1][2][4] Vzhledem ke své povaze in vitro však tento test nemůže přesně předpovědět rychlost transkripce genů specifických pro buňky, na rozdíl od in vivo testů, jako je nukleární test.[1][2]

Chcete-li provést odběrovou transkripční zkoušku, požadovaný gen, včetně promotér, je klonován do a plazmid[4]. Plazmid je štěpen známým restrikční enzym odřízněte místo po proudu od počátečního místa transkripce tak, aby se očekávalo mRNA odtokový produkt by byl snadno oddělen Gelová elektroforéza.[1][2][4]DNA musí být před provedením tohoto testu vysoce purifikována.[1] [2] Chcete-li zahájit přepis, radioaktivně značené UTP, jiný nukleotidy, a RNA polymeráza se přidají k linearizované DNA.[1][2] Transkripce pokračuje, dokud RNA polymeráza nedosáhne konce DNA, kde jednoduše „odtéká“ z templátu DNA, což vede k fragmentu mRNA definované délky.[1][2] Tento fragment lze poté oddělit gelovou elektroforézou, vedle standardů velikosti, a autoradiografovat.[1][2][4] Odpovídající velikost pásu bude představovat velikost mRNA od místa štěpení restrikčním enzymem po místo zahájení transkripce (+1).[4] Intenzita pásma bude indikovat množství produkované mRNA.[4]

Dále může být použit k detekci, zda se transkripce provádí za určitých podmínek (tj. Za přítomnosti různých chemikálií).[5]


Reference

  1. ^ A b C d E F G h Loewenstein, P. M .; Song, C. Z .; Green, M (2007). "Použití transkripce in vitro ke zkoumání regulačních funkcí domén virových proteinů". Metody v molekulární medicíně. 131: 15–31. PMID  17656772.
  2. ^ A b C d E F G h „Přepis run-off“. Molekulární stanice. Archivovány od originál dne 22. dubna 2014. Citováno 16. dubna 2014.
  3. ^ Lelandais, C; Gutierres, S; Mathieu, C; Vedel, F; Remacle, C; Maréchal-Drouard, L; Brennicke, A; Binder, S; Chétrit, P (1996). "Promotorový prvek aktivní v odtokové transkripci řídí expresi dvou cistronů genů nad a rps v Nicotiana sylvestris mitochondria". Výzkum nukleových kyselin. 24 (23): 4798–804. doi:10.1093 / nar / 24.23.4798. PMC  146301. PMID  8972868.
  4. ^ A b C d E F Allison, Lizabeth. „Základní molekulární biologie, kapitola 11“ (PDF). BlackWell Publishing. Citováno 18. dubna 2014.
  5. ^ Sanchez, Alvaro; Osborne, Melisa L .; Friedman, Larry J .; Kondev, Jane; Gelles, Jeff (2011). "Mechanismus transkripční represe na bakteriálním promotoru analýzou jednotlivých molekul". Časopis EMBO. 30 (19): 3940–3946. doi:10.1038 / emboj.2011.273. PMC  3209775. PMID  21829165.