PEGylace lyzozymu - Lysozyme PEGylation

Tento článek je o PEGylaci ve farmaceutickém kontextu. Podrobný popis lysozymu viz Lyzozym.

PEGylace lyzozymu je kovalentní vazba Polyethylenglykol (PEG) na lyzozym, který je jedním z nejčastěji zkoumaných PEGylovaných proteinů.

The PEGylace bílkovin se stala běžnou praxí moderních terapeutických léčiv, protože tento proces je schopen zvýšit rozpustnost, tepelnou stabilitu, odolnost vůči enzymové degradaci a sérový poločas sledovaných proteinů.[1][2] Lyzozym, jako přírodní baktericidní enzym, lyžuje buněčnou stěnu různých grampozitivní bakterie a nabízí ochranu před mikrobiálními infekcemi.[2] Lysozym má šest lysinových zbytků, které jsou přístupné pro PEGylační reakce.[3] To znamená, že PEGylace z lysozym nebo PEGylace lysozymem, může být dobrým modelovým systémem pro PEGylaci jiných proteinů s enzymatickými aktivitami tím, že ukazuje zvýšení jeho fyzikální a tepelné stability při zachování jeho aktivity. [2]

Předchozí práce na PEGylaci lysozymu ukázaly různá chromatografická schémata za účelem čištění PEGylovaného lysozymu, který zahrnoval iontoměničová chromatografie, hydrofobní interakční chromatografie, a vylučovací chromatografie (rychlá proteinová kapalinová chromatografie ), a prokázal svou stabilní konformaci prostřednictvím kruhový dichroismus a zlepšená tepelná stabilita pomocí testů enzymatické aktivity, SDS-PAGE, a vylučovací chromatografie (vysoce účinná kapalinová chromatografie ).[1][4][5]

Metodologie

PEGylace

Chemická modifikace lysozym podle PEGylace Zahrnuje přidání methoxy-PEG-aldehydu (mPEG-aldehyd) s různými velikostmi molekul, v rozmezí od 2 kDa do 40 kDa, k proteinu.[6][7] Protein a mPEG-aldehyd se rozpustí za použití a fosforečnan sodný nárazník s kyanoborohydrid sodný, který funguje jako redukční činidlo a podmínky aldehydové skupiny mPEG-aldehydu mají silnou afinitu k lysinovému zbytku na N-konci lysozymu.[7] Běžně používaný molární poměr lysozymu a mPEG-aldehydu je 1: 6 nebo 1: 6,67.[6][5] Když je to dostačující PEGylace Pokud je dosaženo, reakce může být ukončena přidáním lysinu k roztoku nebo varem roztoku.[2][8] Různé profily mohou mít za následek PEGylace proteinu, který zahrnuje intaktní mono-PEGylované, di-PEGylované, tri-PEGylované a případně také jejich izoformy.[5]

Čištění

Iontoměničová chromatografie

Iontoměničová chromatografie se často používá v prvním kroku nebo v kroku zachycení pro separaci PEGylovaných proteinů jako PEGylace může ovlivnit náboje cílových proteinů neutralizací elektrostatická interakce, změna izoelektrický bod (pI) a zvýšení pKa hodnota[2]. Kvůli vysoké pI lysozymu (pí = 10,7) se použije kationtoměničová chromatografie.[2][9] Jako zvýšený stupeň PEGylace snižuje iontovou sílu proteinu, mají poly-PEGylované proteiny tendenci se vázat na kationtovou pryskyřici slabší než mono-PEGylovaný protein nebo intaktní forma. Poly-PEGylované proteiny tedy eluují rychleji a intaktní protein uniká jako poslední v kationtoměničové chromatografii.[10] Protože mono-PEGylovaný je široce zkoumán a popsán jako ochrana cílových proteinů, cíl eluát v kationtoměničové chromatografii jsou obvykle mono-PEGylované proteiny.[7]

Hydrofobní interakční chromatografie

Přes schopnost katexové chromatografie v procesu čištění, hydrofobní interakční chromatografie se také používá, obvykle ve druhém kroku jako leštící krok. Použitím kationtové pryskyřice o relativně malé velikosti kuliček může kationtoměničová chromatografie identifikovat a oddělit se izoformy zjevnými poplatky ve stavu, ale hydrofobní interakční chromatografie je schopen identifikovat a oddělit izoformy jejich hydrofobicitou.[11]

Vylučovací chromatografie (FPLC)

Vzhledem ke zjevným rozdílům ve velikosti o stupeň PEGylace bílkovin, vylučovací chromatografie (rychlá proteinová kapalinová chromatografie nebo FPLC).[4][5] Existuje negativní korelace mezi molekulární váha a retenční čas PEGylovaného proteinu na chromatogramu; větší protein nebo více PEGylovaného proteinu se vymývá jako první a menší protein nebo neporušený protein nejnovější.[2]

Charakterizace

Identifikace

Nejběžnější analýzy pro identifikaci intaktního a PEGylovaného lysozymu lze dosáhnout pomocí vylučovací chromatografie (vysoce účinná kapalinová chromatografie nebo HPLC), SDS-PAGE a Maticová laserová desorpce / ionizace (MALDI).[2]

Konformace

Sekundární strukturu intaktního a PEGylovaného lysozymu lze charakterizovat pomocí cirkulární dichroismus (CD) spektroskopie.[4][7] Rozsah CD spektra od 189 do 260 nm s roztečí 0,1 nm neukázal žádnou významnou změnu v sekundární struktuře intaktního a PEGylovaného lysozymu.[4][7]

Stanovení enzymatické aktivity

Glykol chitosan

Enzymatická aktivita neporušeného a PEGylovaného lysozymu lze vyhodnotit za použití glykolchitosanu reakcí 1 ml 0,05% (hmotn./obj.) glykolchitosanu ve 100 mM pufru acetátu s pH 5,5 a 100 μL intaktního nebo PEGylovaného proteinu při 40 ° C po dobu 30 minut následně se přidají 2 ml 0,5 M uhličitanu sodného s 1 μg ferikyanid draselný.[12] Směs se okamžitě zahřeje, 15 minut vaří a ochladí pro spektrální analýzu při 420 nm.[12] Protože po PEGylaci byla zachována enzymatická aktivita hydrolyzující p-1,4-N-acetylglukosaminovou vazbu, nedocházelo k rozkladu v enzymatické aktivitě zvyšováním stupně PEGylace.[4]

Micrococcus lysodeikticus

Měřením poklesu zákalu o M. lysodeikticus inkubací s lysozymem, enzymatická aktivita lze vyhodnotit.[13] 7,5 μl 0,1 - 1 mg / ml bílkovin se přidá do 200 μl M. lysodeikticus na jeho optická hustota (OD) 1,7 AU a směs se pravidelně měří při 450 nm pro výpočet reakční rychlosti.[5][13] Na rozdíl od výsledku z glykolchitosanové enzymatické aktivity, zvyšující se stupeň PEGylace snížil enzymatickou aktivitu.[4][5] Tento rozdíl v trendu enzymatické aktivity může být způsoben PEGylací na volný lysin, která způsobuje sterické zábrany a následně brání tvorbě komplex enzym-substrát v případě reakce s makromolekulou, jako je např M. lysodeikticus.[4][5][14]

Reference

  1. ^ A b Poplatek, Conan (18. září 2009). PEGylované proteinové léky: základní věda a klinické aplikace. Birkhäuser. p. 113–124. ISBN  978-3-7643-8678-8.
  2. ^ A b C d E F G h da Silva Freitas, Débora; Abrahão-Neto, José (15. června 2010). "Biochemická a biofyzikální charakterizace lysozymu modifikovaného PEGylací". International Journal of Pharmaceutics. 392 (1–2): 111–117. doi:10.1016 / j.ijpharm.2010.03.036. PMID  20307635.
  3. ^ "Charakterizační studie pegylovaného lyzozymu". Analytický vědec. Citováno 2020-07-17.
  4. ^ A b C d E F G da Silva Freitas, Débora; Abrahão-Neto, José (2010-06-15). "Biochemická a biofyzikální charakterizace lysozymu modifikovaného PEGylací". International Journal of Pharmaceutics. 392 (1–2): 111–117. doi:10.1016 / j.ijpharm.2010.03.036. PMID  20307635.
  5. ^ A b C d E F G Pai, Sheetal S .; Hammouda, Boualem; Hong, Kunlun; Pozzo, Danilo C .; Przybycien, Todd M .; Tilton, Robert D. (2011-11-16). „Konformace poly (ethylenglykolového) řetězce v mono-PEGylovaném lyzozymu a mono-PEGylovaném lidském růstovém hormonu“. Chemie biokonjugátu. 22 (11): 2317–2323. doi:10.1021 / bc2003583. ISSN  1043-1802. PMID  21950579.
  6. ^ A b Morgenstern, Josefine; Baumann, Pascal; Brunner, Carina; Hubbuch, Jürgen (19. 1. 2017). "Vliv molekulární hmotnosti PEG a stupně PEGylace na fyzickou stabilitu PEGylovaného lysozymu". International Journal of Pharmaceutics. 519 (1–2): 408–417. doi:10.1016 / j.ijpharm.2017.01.040. PMID  28130198.
  7. ^ A b C d E Maiser, Benjamin; Dismer, Florian; Hubbuch, Jürgen (2014). "Optimalizace náhodných PEGylačních reakcí pomocí vysoce výkonného screeningu". Biotechnologie a bioinženýrství. 111 (1): 104–114. doi:10,1002 / bit. 25000. ISSN  1097-0290. PMID  23939788. S2CID  205503389.
  8. ^ Ottow, Kim Ekelund; Lund-Olesen, Torsten; Maury, Trine Lütken; Hansen, Mikkel Fougt; Hobley, Timothy J. (2011). „Proces magnetické adsorpce pro semikontinuální PEGylaci proteinů“. Biotechnology Journal. 6 (4): 396–409. doi:10,1002 / biot.201000360. ISSN  1860-7314. PMID  21259443.
  9. ^ Abeyrathne, E.D.N.S .; Lee, H. Y .; Ahn, D.U. (2014-12-11). „Sekvenční separace lysozymu, ovomucinu, ovotransferrinu a ovalbuminu z vaječného bílku“. Drůbeží věda. 93 (4): 1001–1009. doi:10.3382 / ps.2013-03403. PMID  24706978.
  10. ^ Poplatek, Conan J .; Van Alstine, James M. (08.11.2005). "PEG-proteiny: Reakční inženýrství a separační problémy". Věda o chemickém inženýrství. 61 (3): 924–939. doi:10.1016 / j.ces.2005.04.040.
  11. ^ Lee, K. C .; Tak, K. K .; Park, M. O .; Lee, J. T .; Woo, B. H .; Yoo, S. D .; Lee, H. S .; DeLuca, P. P. (01.05.1999). "Příprava a charakterizace lososích kalcitoninů modifikovaných polyethylenglykolem". Farmaceutický vývoj a technologie. 4 (2): 269–275. doi:10.1081 / pdt-100101361. ISSN  1083-7450. PMID  10231888.
  12. ^ A b Imoto, Taiji; Yagishita, Kazuyoshi (1971-04-24). "Jednoduché měření aktivity lyzozymu". Zemědělská a biologická chemie. 35 (7): 1154–1156. doi:10.1080/00021369.1971.10860050. ISSN  0002-1369.
  13. ^ A b Shugar, David (29.02.1952). „Měření aktivity lysozymu a ultrafialová inaktivace lysozymu“. Biochimica et Biophysica Acta. 8 (3): 302–309. doi:10.1016/0006-3002(52)90045-0. PMID  14934741.
  14. ^ Nodake, Yuichi; Yamasaki, Nobuyuki (1999-11-25). „Některé vlastnosti makromolekulárního konjugátu lysozymu připraveného modifikací derivátem monomethoxypolyethylenglykolu“. Bioscience, biotechnologie a biochemie. 64 (4): 767–774. doi:10,1271 / bbb.64,767. ISSN  0916-8451. PMID  10830491. S2CID  2851002.