Rychlá proteinová kapalinová chromatografie - Fast protein liquid chromatography - Wikipedia

Rychlá proteinová kapalinová chromatografie
AkronymFPLC
KlasifikaceChromatografie
VýrobciSystém NGC Bio-Rad Laboratories ), Arista Slice (Practichem ), ÄKTAFPLC (GE Healthcare, Pharmacia ), Contichrom (ChromaCon ), BioSMB (Pall Life Sciences )
Další techniky
PříbuznýVysoce účinná kapalinová chromatografie
Afinitní chromatografie

Rychlá proteinová kapalinová chromatografie (FPLC), je forma kapalinová chromatografie který se často používá k analýze nebo čištění směsí proteinů. Stejně jako v jiných formách chromatografie je separace možná, protože různé složky směsi se liší spřízněnosti u dvou materiálů pohyblivá tekutina ( Mobilní fáze ) a porézní pevná látka ( stacionární fáze ). Ve FPLC je mobilní fáze vodný roztok nebonárazník ".[1] Průtok pufru je řízen objemovým čerpadlem a je obvykle udržován konstantní, zatímco složení pufru lze měnit čerpáním tekutin v různých poměrech ze dvou nebo více externích zásobníků. Stacionární fáze je a pryskyřice složený z korálků, obvykle zesítěné agarózy, balených do válcového skleněného nebo plastového sloupce. FPLC pryskyřice jsou k dispozici v široké škále velikostí kuliček a povrchových ligandů v závislosti na aplikaci.

V nejběžnější strategii FPLC iontová výměna, je zvolena pryskyřice, že se požadovaný protein váže na pryskyřici interakcí náboje, zatímco je v pufru A (běžící pufr), ale disociuje se a vrací se do roztoku v pufru B (eluční pufr). Směs obsahující jeden nebo více požadovaných proteinů se rozpustí ve 100% pufru A a načerpá se do kolony. Požadované proteiny se vážou na pryskyřici, zatímco jiné složky se provádějí v pufru.[2] Celkový průtok vyrovnávací paměti je udržován konstantní; podíl pufru B („eluční“ pufr) se však postupně zvyšuje z 0% na 100% podle naprogramované změny koncentrace („gradient“). V určitém okamžiku tohoto procesu každý z vázaných proteinů disociuje a objeví se v eluent. Eluční činidlo prochází dvěma detektory, které měří koncentraci solí (vodivostí) a koncentraci bílkovin (absorpcí kyslíku) ultrafialové světlo při vlnové délce 280 nm). Jakmile je každý protein eluován, jeví se v eluátu jako „vrchol“ v koncentraci proteinu a lze jej shromáždit pro další použití.[3]

FPLC vyvinula a uvedla na trh ve Švédsku společnost Pharmacia v roce 1982,[4] a původně byl volán rychlá kapalinová chromatografie kontrastovat s HPLC nebo vysoce účinná kapalinová chromatografie. FPLC se obecně aplikuje pouze na proteiny; ale vzhledem k širokému výběru pryskyřic a pufrů má široké uplatnění. Na rozdíl od HPLC je použitý tlak pufru relativně nízký, typicky nižší než 5 bar, ale průtok je relativně vysoká, obvykle 1-5 ml / min. FPLC lze snadno škálovat od analýzy miligramů směsí ve sloupcích s celkovým objemem 5 ml nebo méně až po průmyslovou výrobu kilogramů čištěného proteinu ve sloupcích s objemy mnoha litrů. Při použití pro analýzu směsí se eluent obvykle shromažďuje ve frakcích o objemu 1 až 5 ml, které lze dále analyzovat (například MALDI hmotnostní spektrometrie ). Při použití pro čištění bílkovin mohou existovat pouze dvě sběrné nádoby: jedna pro vyčištěný produkt a druhá pro odpad.[5]

Komponenty systému FPLC

Typická laboratorní FPLC se skládá z jednoho nebo dvou vysoce přesných čerpadel, řídicí jednotky, kolony, detekčního systému a sběrače frakcí. I když je možné systém ovládat ručně, komponenty jsou obvykle propojeny s osobním počítačem nebo u starších jednotek s mikrokontrolérem.

Čerpadla

Většina systémů využívá dva dvouválce pístová čerpadla, jeden pro každý pufr, kombinující výstup obou ve směšovací komoře. Některé jednodušší systémy používají jediné peristaltické čerpadlo, které čerpá oba nárazníky ze samostatných zásobníků přes dávkovací ventil a směšovací komoru. V obou případech systém umožňuje kontinuální změnu podílu každého pufru vstupujícího do sloupce. Průtok se může pohybovat od několika mililitrů za minutu u stolních systémů až po litry za minutu při čištění v průmyslovém měřítku. Díky širokému rozsahu průtoku je vhodný jak pro analytickou, tak pro preparativní chromatografii.

Injekční smyčka

Injekční smyčka je segment hadiček známého objemu, který je naplněn roztokem vzorku před jeho vstřikováním do kolony. Objem smyčky se může pohybovat od několika mikrolitrů do 50 ml nebo více.

Vstřikovací ventil

Vstřikovacím ventilem je motorický ventil, který spojuje směšovač a smyčku vzorku se sloupcem. Typicky má ventil tři polohy pro plnění smyčky vzorku, pro vstřikování vzorku ze smyčky do kolony a pro připojení čerpadel přímo k odpadnímu potrubí pro jejich promývání nebo výměnu pufrovacích roztoků. Injekční ventil má port pro plnění vzorku, kterým lze vzorek natáhnout do injekční smyčky, obvykle z injekční stříkačky pomocí Luer-lock spojení.

Sloupec

Kolona je skleněný nebo plastový válec naplněný kuličkami pryskyřice a naplněný pufrovacím roztokem. Obvykle je namontován svisle a vyrovnávací paměť teče dolů shora dolů. Skleněná frita ve spodní části kolony zadržuje pryskyřičné kuličky ve koloně, přičemž umožňuje pufru a rozpuštěným proteinům odejít.

Průtočná cela

Eluční činidlo z kolony prochází jednou nebo více průtokovými buňkami pro měření koncentrace proteinu v Eluční látce (absorpcí UV světla při 280 nm). Buňka vodivosti měří vodivost pufru, obvykle v milisiemens / cm, což indikuje koncentraci soli v pufru. Obvykle je také zahrnuta průtoková cela, která měří pH pufru. Obvykle je každá průtoková cela připojena k samostatnému elektronickému modulu, který poskytuje energii a zesiluje signál.

Monitor / zapisovač

Průtočné cely jsou připojeny k displeji a / nebo zapisovači. Na starších systémech to byl jednoduchý zapisovač map, na moderních systémech se používá počítač s hardwarovým rozhraním a displejem. To umožňuje experimentátorovi identifikovat, kdy nastanou vrcholy v koncentraci proteinu, což naznačuje, že jsou eluovány specifické složky směsi.

Sběrač frakcí

Sběračem frakcí je obvykle rotující stojan, který lze naplnit zkumavkami nebo podobnými nádobami. Umožňuje odebírat vzorky ve stálých objemech nebo jej lze řídit tak, aby nasměroval specifické frakce detekované jako vrcholy koncentrace proteinu do samostatných nádob.

Mnoho systémů obsahuje různé volitelné součásti. Mezi mixér a kolonu lze přidat filtr, aby se minimalizovalo ucpání. Ve velkých FPLC kolonách může být vzorek naložen do kolony přímo pomocí malé peristaltické pumpy místo injekční smyčky. Pokud pufr obsahuje rozpuštěný plyn, mohou se při poklesu tlaku v místě výstupu z kolony tvořit bubliny; tyto bubliny vytvářejí artefakty, pokud procházejí průtokovými buňkami. Tomu lze zabránit odplyněním nárazníků, např. s odplyňovač, nebo přidáním a omezovač průtoku po proudu od průtokových buněk k udržení tlaku 1 až 5 barů v potrubí s elučním činidlem.

Sloupce FPLC

Kolony používané v FPLC jsou velké [mm id] zkumavky, které obsahují malé [u] částice nebo gelové kuličky, které jsou známé jako stacionární fáze.[6] Chromatografické lože je tvořeno gelovými kuličkami uvnitř kolony a vzorek je zaveden do injektoru a nesen do kolony proudícím rozpouštědlem. V důsledku různých složek ulpívajících na gelu nebo difundujících gelem se směs vzorků oddělí.[7]

Sloupce používané s FPLC mohou oddělit makromolekuly na základě velikosti, distribuce poplatků (iontová výměna ), hydrofobnost, reverzní fáze nebo biologické rozpoznávání (jako u afinitní chromatografie ).[8] Pro snadné použití je k dispozici široká škála předplněných kolon pro techniky, jako je iontová výměna, gelová filtrace (vyloučení velikosti), hydrofobní interakce a afinitní chromatografie.[9] FPLC se liší od HPLC v tom, že kolony použité pro FPLC lze použít pouze do maximálního tlaku 3-4 MPa (435-580 psi). Pokud tedy může být tlak HPLC omezen, může být každá kolona FPLC také použita v zařízení pro HPLC.

Optimalizace čištění bílkovin

K čištění cílové molekuly lze použít kombinace chromatografických metod. Účelem čištění proteinů pomocí FPLC je dodávat množství cíle v dostatečné čistotě v biologicky aktivním stavu, aby vyhovovalo jeho dalšímu použití. Kvalita konečného produktu se liší v závislosti na typu a množství výchozího materiálu, účinnosti separace a selektivitě čisticí pryskyřice. Konečným cílem daného purifikačního protokolu je poskytnout požadovaný výtěžek a čistotu cílové molekuly nejrychlejším, nejlevnějším a nejbezpečnějším způsobem pro přijatelné výsledky. Rozsah požadované čistoty může být od rozsahu požadovaného pro základní analýzu (SDS-PAGE nebo ELISA, například), s odstraněnými pouze hromadnými nečistotami, na dostatečně čistý pro strukturní analýzu (NMR nebo Rentgenová krystalografie ), blížící se> 99% cílové molekule. Požadovaná čistota může také znamenat dostatečně čistou, aby byla zachována biologická aktivita cíle. Tyto požadavky lze použít k určení množství výchozího materiálu potřebného k dosažení experimentálního cíle. Pokud je výchozí materiál omezený a nelze provést úplnou optimalizaci čisticího protokolu, očekává se bezpečný standardní protokol, který vyžaduje minimální úpravy a optimalizační kroky . To nemusí být optimální s ohledem na experimentální čas, výnos a ekonomiku, ale bude dosaženo experimentálního cíle. Na druhou stranu, pokud je výchozí materiál dostatečný pro vývoj úplnějšího protokolu, množství práce k dosažení cíle separace závisí na dostupných informacích o vzorku a vlastnostech cílové molekuly. Omezení vývoje protokolů čištění mnohokrát závisí na zdroji látky, která má být čištěna, ať už z přírodních zdrojů (například sklizené tkáně nebo organismy), rekombinantních zdrojů (jako je použití prokaryotických nebo eukaryotických vektorů v jejich příslušných expresních systémech), nebo zcela syntetické zdroje.

Žádné chromatografické techniky neposkytují 100% výtěžek aktivního materiálu a celkové výtěžky závisí na počtu kroků v čisticím protokolu. Optimalizací každého kroku pro zamýšlený účel a jejich uspořádáním, které minimalizuje mezikrokové úpravy, bude počet kroků minimalizován.

Typický vícestupňový čisticí protokol začíná krokem předběžného zachycení, který se často využívá iontoměničová chromatografie (IEC). Mediální (stacionární fáze) pryskyřice se skládá z kuliček, jejichž velikost se pohybuje od velké (dobré pro rychlé průtoky a malé nebo žádné objasnění vzorku na úkor rozlišení) až po malé (pro nejlepší možné rozlišení se všemi ostatními faktory stejnými) . Geometrie krátkých a širokých kolon jsou přístupné vysokým rychlostem toku také na úkor rozlišení, obvykle kvůli boční difúzi vzorku na koloně. Aby byly techniky, jako je vylučovací chromatografie, užitečné, jsou vyžadovány velmi dlouhé, tenké kolony a minimální objemy vzorků (maximálně 5% objemu kolony). Hydrofobní interakční chromatografie (HIC) může být také použita pro první a / nebo mezikroky. Selektivita v HIC je nezávislá na běžícím pH a používají se sestupné gradienty solí. U HIC zahrnuje kondicionování přidání síranu amonného do vzorku, aby odpovídala koncentraci pufru A. Pokud se použije HIC před IEC, musela by být iontová síla snížena, aby odpovídala pufru A pro krok IEC ředěním, dialýzou nebo výměnou pufru gelovou filtrací. To je důvod, proč se IEC obvykle provádí před HIC, protože podmínky eluce s vysokou solí pro IEC jsou ideální pro navázání na HIC pryskyřice v dalším kroku čištění. Leštění se používá k dosažení požadované konečné úrovně čištění a běžně se provádí na gelové filtrační koloně. Může být přidán další mezistupňový krok čištění nebo je provedena optimalizace různých kroků pro zlepšení čistoty. Tento další krok obvykle zahrnuje další kolo IEC za zcela odlišných podmínek.

Přestože se jedná o příklad běžného čisticího protokolu pro proteiny, lze zvolit podmínky pufru, průtokové rychlosti a pryskyřice použité k dosažení konečných cílů tak, aby pokrývaly širokou škálu cílových proteinů. Tato flexibilita je pro funkční systém čištění nezbytná, protože všechny proteiny se chovají odlišně a často se odchylují od předpovědí.[10]

Reference

  1. ^ Pontis HG (01.01.2017). „Kapitola 3 - Oddělení a čištění bílkovin a sacharidů“. V Pontis HG (ed.). Metody pro analýzu metabolismu sacharidů ve fotosyntetických organizmech. Boston: Academic Press. str. 45–63. doi:10.1016 / b978-0-12-803396-8.00003-x. ISBN  978-0-12-803396-8.
  2. ^ Rutkowski JM, Scherer PE (01.01.2014). Macdougald O (ed.). „Izolace a kvantifikace komplexů adiponektinu vyššího řádu“. Metody v enzymologii. Metody biologie tukové tkáně, část A. Academic Press. 537: 243–59. doi:10.1016 / b978-0-12-411619-1.00013-6. ISBN  9780124116191. PMC  4040967. PMID  24480350.
  3. ^ „Chromatografie, teorie, FPLC a další“ (PDF). Archivovány od originál (PDF) dne 2014-03-28.>
  4. ^ Moreno-Arribas MV (01.01.2003), „CHROMATOGRAPHY | High-performance Liquid Chromatography“, Caballero B, Polo MC (eds.), Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition (druhé vydání), Oxford: Academic Press, s. 1274–1280, doi:10.1016 / b0-12-227055-x / 00232-7, ISBN  978-0-12-227055-0
  5. ^ Sheehan D, O'Sullivan S (2003). "Rychlá proteinová kapalinová chromatografie". V Cutler P (ed.). Protokoly pro čištění proteinů. Metody v molekulární biologii. 244. str. 253–8. doi:10,1385 / 1-59259-655-X: 253. ISBN  978-1-59259-655-3. PMID  14970563.
  6. ^ Aluko RE (leden 2018). „Peptidy odvozené od potravinových proteinů: Výroba, izolace a čištění.“. Proteiny ve zpracování potravin. Woodhead Publishing. 389–412. doi:10.1016 / b978-0-08-100722-8.00016-4. ISBN  978-0-08-100722-8.
  7. ^ „FPLC Vše, co potřebujete vědět“. Když jsou rozpouštědla vytlačována do chromatografického lože průtokem, vzorek se oddělí do různých zón složek vzorku, které se nazývají pásy.>
  8. ^ Verbeke K, Verbruggen A (červen 1996). „Užitečnost rychlé proteinové kapalinové chromatografie jako alternativy k vysoce účinné kapalinové chromatografii přípravků lidského sérového albuminu značených 99mTc“. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 14 (8–10): 1209–13. doi:10.1016 / S0731-7085 (95) 01755-0. PMID  8818035.
  9. ^ Göke B, Keim V (duben 1992). „HPLC a FPLC. Nedávný pokrok v používání automatizovaných chromatografických systémů pro rozlišení sekrečních proteinů pankreatu“. International Journal of Pankreatology. 11 (2): 109–16. doi:10.1007 / BF02925982 (neaktivní 11. 11. 2020). PMID  1607728.CS1 maint: DOI neaktivní od listopadu 2020 (odkaz)
  10. ^ „Příručka Strategies for Protein Purification“ (PDF). GE Healthcare Bio-Sciences AB.

externí odkazy

Příklad posouzení rizik FPLC (Leeper Group, University of Cambridge)