Saturační mutageneze - Saturation mutagenesis - Wikipedia

Nasycená mutageneze jedné pozice v teoretickém 10-zbytkovém proteinu. Verze proteinu divokého typu je zobrazena nahoře, přičemž M představuje první aminokyselinu methionin a * představuje ukončení translace. Všech 19 mutantů na pozici 5 je zobrazeno níže.

Site saturační mutageneze (SSM)nebo jednoduše sytost stránek, je náhodná mutageneze technika používaná v proteinové inženýrství, ve kterém jediný kodon nebo sada kodonů je nahrazena všemi možnými aminokyseliny na pozici.[1] Existuje mnoho variant techniky saturace webů od nasycení spárovaného webu (nasycení dvou pozic u každého mutanta v knihovně) na nasycení stránky skenováním (provedení saturace místa v každém místě proteinu, což má za následek knihovnu velikosti [20 x (počet zbytků v proteinu)], která obsahuje všechny možné bodový mutant bílkoviny).

Metoda

Znázornění jednoho běžného způsobu klonování místně zaměřené knihovny mutageneze (tj. Použití degenerovaných oligonukleotidů). Požadovaný gen je PCR s oligony, které obsahují oblast, která je dokonale komplementární s templátem (modrá), a oblastí, která se liší od templátu jedním nebo více nukleotidy (červená). Mnoho takových primerů obsahujících degeneraci v nekomplementární oblasti je spojeno do stejné PCR, což vede k mnoha různým produktům PCR s různými mutacemi v této oblasti (jednotlivé mutanty zobrazené níže různými barvami).

Nasycení mutageneze se běžně dosahuje pomocí místně zaměřená mutageneze PCR s randomizovaným kodonem v primerech (např. SeSaM )[2] nebo umělá genová syntéza se směsí syntézy nukleotidy použité v kodonech, které mají být randomizovány.[3]

K kódování sad aminokyselin lze použít různé degenerované kodony.[1] Protože některé aminokyseliny jsou kódovány více kodony než jiné, přesný poměr aminokyselin nemůže být stejný. Navíc je obvyklé používat degenerované kodony, které minimalizují stop kodony (které obecně nejsou žádoucí). V důsledku toho není plně randomizovaný „NNN“ ideální a používají se alternativní omezenější degenerované kodony. 'NNK' a 'NNS' mají výhodu kódování všech 20 aminokyselin, ale přesto kódují stop kodon 3% času. Alternativní kodony jako „NDT“, „DBK“ se stop kodonům zcela vyhýbají a kódují minimální soubor aminokyselin, které stále obsahují všechny hlavní biofyzikální typy (aniontové, kationtové, alifatické hydrofobní, aromatické, hydrofobní, hydrofilní, malé).[1] V případě, že neexistuje žádné omezení pro použití pouze jediného degenerovaného kodonu, je možné podstatně snížit zkreslení.[4][5] Bylo vyvinuto několik výpočetních nástrojů, které umožňují vysokou úroveň kontroly nad degenerovanými kodony a jejich odpovídajícími aminokyselinami.[6][7][8]

Degenerovat kodonPočet kodonůPočet aminokyselinPočet zastávekAminokyseliny kódované
NNN64203Všech 20
NNK / NNS32201Všech 20
NDT12120RNDCGHILFSYV
DBK18120ARCGILMFSTWV
NRT880RNDCGHSY

Aplikace

Saturační mutageneze se běžně používá ke generování variant pro řízená evoluce.[9][10]

Viz také

Reference

  1. ^ A b C Reetz, M. T .; Carballeira J. D. (2007). „Iterativní saturační mutageneze (ISM) pro rychlý řízený vývoj funkčních enzymů“. Přírodní protokoly. 2 (4): 891–903. doi:10.1038 / nprot.2007.72. PMID  17446890.
  2. ^ Zheng, Lei; Baumann, Ulrich; Reymond, Jean-Louis (2004-07-15). „Efektivní jednokrokový protokol zaměřený na místo a nasycení mutageneze“. Výzkum nukleových kyselin. 32 (14): e115. doi:10.1093 / nar / gnh110. ISSN  0305-1048. PMC  514394. PMID  15304544.
  3. ^ Reetz, Manfred T .; Prasad, Shreenath; Carballeira, José D .; Gumulya, Yosephine; Bocola, Marco (07.07.2010). „Iterativní saturační mutageneze urychluje vývoj laboratoře enzymové stereoselektivity: důkladné srovnání s tradičními metodami“. Journal of the American Chemical Society. 132 (26): 9144–9152. doi:10.1021 / ja1030479. ISSN  0002-7863. PMID  20536132.
  4. ^ Kille, Sabrina; Acevedo-Rocha, Carlos G .; Parra, Loreto P .; Zhang, Zhi-Gang; Opperman, Diederik J .; Reetz, Manfred T .; Acevedo, Juan Pablo (2013-02-15). "Snížení redundance kodonů a screeningové úsilí knihoven kombinatorických proteinů vytvořených saturační mutagenezí". ACS Syntetická biologie. 2 (2): 83–92. doi:10.1021 / sb300037w. PMID  23656371.
  5. ^ Tang, Lixia; Wang, Xiong; Ru, Beibei; Sun, Hengfei; Huang, Jian; Gao, Hui (červen 2014). „MDC-Analyzer: a new degenerate primer design tool for the construction of intelligent mutagenesis libraries with contiguous sites“. Biotechniky. 56 (6): 301–302, 304, 306–308, passim. doi:10.2144/000114177. ISSN  1940-9818. PMID  24924390.
  6. ^ Halweg-Edwards, Andrea L .; Pines, Gur; Winkler, James D .; Pines, Assaf; Gill, Ryan T. (16. září 2016). "Webové rozhraní pro kompresi kodonů". ACS Syntetická biologie. 5 (9): 1021–1023. doi:10.1021 / acssynbio.6b00026. ISSN  2161-5063. PMID  27169595.
  7. ^ Engqvist, Martin K. M .; Nielsen, Jens (2015-04-30). „ANT: Software pro generování a hodnocení degenerovaných kodonů pro přirozené a rozšířené genetické kódy“. ACS Syntetická biologie. 4 (8): 935–938. doi:10.1021 / acssynbio.5b00018. PMID  25901796.
  8. ^ Kell, Douglas B .; Day, Philip J .; Breitling, Rainer; Zelená, Lucy; Currin, Andrew; Swainston, Neil (10.7.2017). „CodonGenie: optimalizované nejednoznačné návrhové nástroje pro kodony“. PeerJ Computer Science. 3: e120. doi:10,7717 / peerj-cs.120. ISSN  2376-5992.
  9. ^ Chica, Robert A .; et al. (2005). „Poloracionální přístupy k inženýrské aktivitě enzymů: kombinace výhod řízené evoluce a racionálního designu“. Aktuální názor na biotechnologie. 16 (4): 378–384. doi:10.1016 / j.copbio.2005.06.004. PMID  15994074.
  10. ^ Shivange, Amol V; Marienhagen, Jan; Mundhada, Hemanshu; Schenk, Alexander; Schwaneberg, Ulrich (01.02.2009). "Pokroky ve vytváření funkční rozmanitosti pro směrovanou evoluci proteinů". Aktuální názor na chemickou biologii. Biokatalýza a biotransformace / bioanorganická chemie. 13 (1): 19–25. doi:10.1016 / j.cbpa.2009.01.019. PMID  19261539.