Klonování Golden Gate - Golden Gate Cloning

Sestava Golden Gate zahrnuje trávení DNA sekvencí obsahujících místo štěpení restrikčním enzymem typu IIS a jejich ligaci dohromady.

Klonování Golden Gate nebo Sestava Golden Gate[1] je molekulární klonování metoda, která umožňuje výzkumnému pracovníkovi souběžně a směrově sestavovat více DNA fragmenty do jednoho kusu pomocí Restrikční enzymy typu IIs a T4 DNA ligáza.[2] Tato montáž se provádí in vitro. Mezi nejčastěji používané enzymy typu IIS patří BsaI, BsmBI a BbsI.

Na rozdíl od standardních restrikčních enzymů typu II EcoRI a BamHI, tyto enzymy štěpí DNA mimo jejich rozpoznávací místa, a proto mohou vytvářet nepalindromické převisy.[3] Jelikož je možné 256 potenciálních přesahových sekvencí, lze pomocí kombinace přesahových sekvencí sestavit více fragmentů DNA.[3] V praxi to znamená, že klonování Golden Gate je obvykle bez jizvy. Navíc, protože konečný produkt nemá rozpoznávací místo restrikčního enzymu typu II, nemůže být správně ligovaný produkt restrikčním enzymem znovu štěpen, což znamená, že reakce je v podstatě nevratná.[3]

Typický termální cyklovač protokol mnohokrát osciluje mezi 37 ° C (optimální pro restrikční enzymy) a 16 ° C (optimální pro ligázy).[4] Zatímco tuto techniku ​​lze použít pro jeden inzert, vědci použili klonování Golden Gate k sestavení mnoha kusů DNA současně.[5]

Bezproblémové klonování

Jizvové sekvence jsou běžné v sestavě DNA více segmentů. V multisegmentové metodě sestavy Gateway se segmenty přidávají do dárce s dalšími sekvencemi att, které se v těchto přidaných segmentech překrývají, a výsledkem jsou segmenty oddělené sekvencemi att.[6] v Bio cihla sestava, mezi každým segmentem přidaným do plazmidu je ponechána sekvence osmi nukleotidů, která kóduje tyrosin a stop kodon.[6]

Sestava Golden Gate používá restrikční enzymy typu II řezající mimo jejich rozpoznávací sekvence.[6] Stejný restrikční enzym typu II může také generovat velké množství různých převisů na inzertech a vektor, například BsaI vytváří 256 převisů čtyř bází.[6] Pokud jsou přesahy pečlivě navrženy, segmenty jsou ligovány bez jizvových sekvencí mezi nimi a konečný konstrukt může být kvazi-jizvový, kde místa restrikčních enzymů zůstávají na obou stranách inzertu.[6] Protože do vektorů lze vložit další segmenty bez jizev v otevřeném čtecím rámci, je Golden Gate široce používán proteinové inženýrství.[6]

Plazmidový design

Přestože klonování Golden Gate zrychluje vícesegmentové klonování, je nutný pečlivý design plazmidu dárce a příjemce.[5] V každém klonovacím kroku může Golden Gate Cloning sestavit až devět fragmentů a vyžaduje pouze homologii v místech restrikčních enzymů typu II, aby bylo možné fragmenty DNA bezproblémově ligovat.[5] Poté, co jsou fragmenty ligovány, produkt nebude mít původní restrikční místo typu IIS a poté nebude znovu ligován ligační reakcí.[5] Mezitím mohou být původní restrikční místa, která nejsou ligována, redigigována, aby mohla do plazmidu přidat další fragmenty.[5] Pokud jsou fragmenty DNA dobře navrženy tak, aby byly navzájem kompatibilní, mohou být ligovány v lineárním pořadí v jednom kroku.[5]

Klonovací standardy

Sestava restrikčního enzymu DNA má klonovací standardy, aby se minimalizovala změna účinnosti klonování a funkce plazmidu, což může být způsobeno kompatibilitou restrikčních míst na inzertu a na vektoru.[7]

Klonovací standardy sestavy Golden Gate mají dvě úrovně.[7] Prvotřídní sestava Golden Gate konstruuje konstrukt s jedním genem přidáním genetických prvků, jako je promotor, otevřené čtecí rámce a terminátory.[7] Potom sestava Golden Gate druhé úrovně kombinuje několik konstrukcí vytvořených v sestavě první vrstvy, aby vytvořila multigenovou konstrukci.[7] K dosažení sestavy druhého stupně se používá modulární klonovací systém (MoClo) a standard GoldenBraid2.0.[7]

Systém MoClo

Schematický průběh práce pro generování komplexních kombinatorických knihoven DNA

MoClo využívá paralelní přístup, kde všechny konstrukty z první úrovně (moduly úrovně 0) mají restrikční místa pro BpiI na obou stranách vložek. Vektor (také známý jako „cílový vektor“), kam budou přidány geny, má ven směřující BsaI restrikční místo s výsuvnou screeningovou kazetou.[7] LacZ je běžná screeningová kazeta, kde je nahrazena multigenovým konstruktem na cílovém vektoru.[7] Každý konstrukt prvního řádu a vektor mají na sobě různé převisy, ale doplňují se k přesahu dalšího segmentu, což určuje rozložení finálního vícegenového konstruktu.[7] Klonování Golden Gate obvykle začíná moduly úrovně 0.[5] Pokud je však modul úrovně 0 příliš velký, bude klonování začínat z fragmentů úrovně -1, které je třeba sekvenovat, aby se pomohlo klonovat velký konstrukt.[5] Pokud začínáte od fragmentů úrovně -1, není nutné moduly úrovně 0 znovu sekvenovat, zatímco pokud začínáte od modulů úrovně 0, musí se moduly sekvenovat.[5]

Moduly úrovně 0

Moduly úrovně 0 jsou základnou pro systém MoClo, kde obsahují genetické prvky, jako je promotor, 5 'nepřekládaná oblast (UTR), kódovací sekvence a terminátor.[5] Pro účely klonování Golden Gate by interní sekvence modulů úrovně 0 neměly obsahovat místa restrikčních enzymů typu IIS pro BsaI, BpiI a Esp3I, zatímco jsou obklopena dvěma restrikčními místy BsaI v obrácené orientaci.[5] Moduly úrovně 0 bez ohraničujících lokalit typu IIS mohou během procesu klonování Golden Gate přidat weby BsaI.[5]

Pokud moduly úrovně 0 obsahují jakékoli nežádoucí restrikční místo, mohou být mutovány in silico odstraněním jednoho nukleotidu z restrikčního místa typu IIS.[5] V tomto procesu je třeba zajistit, aby zavedená mutace neovlivnila genetickou funkci kódovanou sledovanou sekvencí.[5] Tichá mutace v kódující sekvenci je upřednostňována, protože nemění sekvenci proteinu ani funkci sledovaného genu.[5]

Fragmenty úrovně 1

Fragmenty úrovně 1 se používají ke klonování velkých modulů úrovně 0.[5] Pro klonování fragmentů úrovně -1 lze použít klonování na tupém konci s restrikční ligací.[5] Vektor použitý ve fragmentech úrovně klonování -1 nemůže obsahovat BpiI restrikčního místa typu IIS, které se používá pro následující krok sestavení.[5] Kromě toho by měl mít vektor v dalším kroku montáže také odlišný selekční marker od cílového vektoru, například pokud se v modulech úrovně 0 použije rezistence na spektinomycin, fragmenty úrovně -1 by měly mít další rezistenci na antibiotika, jako je ampicilin.[5] 

Konstrukce úrovně 1

Cílový vektor úrovně 1 určuje polohu a orientaci každého genu v konečném konstruktu.[8] K dispozici je čtrnáct dostupných vektorů úrovně 1, které se liší pouze sekvencí sousedních fúzních míst, zatímco ve vnitřních fúzních místech jsou identické.[8] Všechny vektory tedy mohou sestavovat stejné části úrovně 0.[8]

Protože všechny vektory úrovně 1 jsou binární plazmidy, používají se pro Agrobacterium zprostředkovaný dočasný výraz v rostlinách.[8]

Konstrukce úrovně 2

Vektory úrovně 2 mají dvě invertovaná místa BpiI od vložení modulů úrovně 1.[8] Upstream fúzní místo je kompatibilní s genem klonovaným do vektoru úrovně 1, zatímco downstream fúzní místo má univerzální sekvenci.[8] Každé klonování umožňuje vložení 2-6 genů do stejného vektoru.[8]

Přidání více genů v jednom klonovacím kroku se nedoporučuje, protože by to vedlo k nesprávným konstruktům.[8] Na jedné straně to může indukovat více restrikčních míst v konstruktu, kde tento otevřený konstrukt umožňuje přidat další geny.[8] Na druhou stranu to může také eliminovat restrikční místa, kde tento blízký konstrukt zastaví další přidání genů.[8]

Proto konstrukty více než šesti genů potřebují postupné klonovací kroky, které vyžadují koncové linkery obsahující vnitřní restrikční místa BsaI nebo BsmBI a modré nebo fialové markery.[8] Každý klonovací krok musí střídat restrikční místo a marker.[8] Dále jsou zapotřebí dva restrikční enzymy, kde se BpiI používá k uvolnění modulů úrovně 1 z konstruktů úrovně 1 a BsaI / BsmBI je pro trávení a otevření 2-n plazmidu úrovně příjemce.[8] Při screeningu by se správné kolonie měly střídat od modré po fialovou při každém kroku klonování, ale pokud se použije „uzavřený“ koncový linker, budou kolonie bílé.[8] 

Konstrukce úrovně M.

Vektory úrovně M jsou podobné vektorům úrovně 2, ale mají místo BsaI umístěné před dvěma obrácenými místy BpiI.[9] Když je jeden nebo více genů klonováno do vektoru úrovně M, je přidán druhý BsaI na konec konstruktu prostřednictvím koncového linkeru úrovně M (ref). To umožňuje vyříznutí fragmentu obsahujícího všechny shromážděné geny z vektoru a subklonování v další úrovni klonování (úroveň P).

Konstrukce úrovně P

Vektory úrovně P jsou podobné konstrukcím úrovně M kromě toho, že místa BpiI jsou nahrazena místy BsaI a místa BsaI jsou nahrazena místy BpiI. Několik konstruktů úrovně M s kompatibilními fúzními místy může být subklonováno do vektoru úrovně P v jednom kroku. Teoreticky lze v jednom konstruktu sestavit až 36 genů pomocí 6 reakcí paralelní úrovně M (každá je nutná pro sestavení 6 genů na konstrukci úrovně M), po které následuje jedna reakce P konečné úrovně. V praxi se obvykle sestavuje méně genů, protože většina klonovacích projektů nevyžaduje tolik genů. Struktura vektorů úrovně M a P je navržena takovým způsobem, že geny klonované do konstruktů úrovně P mohou být dále sestaveny do vektorů úrovně M. Opakované klonování na úrovni M a P vektorů tvoří smyčku, kterou lze neomezeně opakovat, aby se sestavily progresivně velké konstrukty.

GoldenBraid

Ve standardním klonování Golden Gate nelze restrikční místa z předchozí konstrukce vrstvy znovu použít.[10] Chcete-li do konstruktu přidat více genů, je třeba do cílového vektoru přidat restrikční místa jiného restrikčního enzymu IIS typu.[10] To lze provést pomocí úrovně 2 nebo M a P. Alternativní verzi úrovně M a P poskytuje také GoldenBraid.

GoldenBraid překonává problém navrhování mnoha cílových vektorů tím, že má dvojitou smyčku, což je „cop“, což umožňuje binární sestavení více konstruktů.[10] Existují dvě úrovně cílových plazmidů, úroveň α a úroveň Ω.[10] Každá hladina plazmidů může být použita jako vstupní plazmidy pro druhou hladinu plazmidů několikrát, protože obě hladiny plazmidů mají různá restrikční místa typu IIS, která jsou v obrácené orientaci.[10] Pro zpětný výběr se dvě hladiny plazmidů liší v markerech rezistence na antibiotika.[10]

Zlatá mutageneze

Princip Golden Gate Cloning lze také použít k provedení mutageneze nazývané Golden Mutagenesis. Tuto technologii lze snadno implementovat, protože pro návrh primeru je k dispozici webový nástroj (https://msbi.ipb-halle.de/GoldenMutagenesisWeb/ ) a vektory jsou uloženy v addgenu (http://www.addgene.org/browse/article/28196591/ ).[11]

Reference

  1. ^ Engler, Carola; Kandzia, Romy; Marillonnet, Sylvestre (11.11.2008). „Jediná metoda, jeden krok, přesná metoda klonování s vysokou propustností“. PLOS ONE. 3 (11): e3647. Bibcode:2008PLoSO ... 3.3647E. doi:10.1371 / journal.pone.0003647. ISSN  1932-6203. PMC  2574415. PMID  18985154.
  2. ^ Biolabs, New England. „Golden Gate Assembly | NEB“. www.neb.com. Citováno 2017-04-26.
  3. ^ A b C Weber, Ernst; Engler, Carola; Gruetzner, Ramona; Werner, Stefan; Marillonnet, Sylvestre (18.02.2011). „Modulární klonovací systém pro standardizované sestavení multigenových konstrukcí“. PLOS ONE. 6 (2): e16765. Bibcode:2011PLoSO ... 616765W. doi:10.1371 / journal.pone.0016765. ISSN  1932-6203. PMC  3041749. PMID  21364738.
  4. ^ Engler, Carola; Gruetzner, Ramona; Kandzia, Romy; Marillonnet, Sylvestre (2009-05-14). „Golden Gate Shuffling: One-Pot DNA Shuffling Method based on Type IIs Restriction Enzymes“. PLOS ONE. 4 (5): e5553. Bibcode:2009PLoSO ... 4.5553E. doi:10.1371 / journal.pone.0005553. ISSN  1932-6203. PMC  2677662. PMID  19436741.
  5. ^ A b C d E F G h i j k l m n Ó str q r s Engler, Carola; Marillonnet, Sylvestre (01.01.2014). "Klonování Golden Gate". Metody v molekulární biologii. 1116: 119–131. doi:10.1007/978-1-62703-764-8_9. ISBN  978-1-62703-763-1. ISSN  1940-6029. PMID  24395361.
  6. ^ A b C d E F Sands, Bryan; Brent, Roger (01.01.2016). „Overview of post Cohen-Boyer methods for single segment cloning and for multisegment DNA assembly“. Současné protokoly v molekulární biologii. 113 (1): 3.26.1–3.26.20. doi:10.1002 / 0471142727.mb0326s113. ISSN  1934-3647. PMC  4853029. PMID  27152131.
  7. ^ A b C d E F G h Casini, Arturo; Storch, Marko; Baldwin, Geoffrey S .; Ellis, Tom (2015). „Cihly a plány: metody a standardy pro sestavování DNA“ (PDF). Recenze přírody. Molekulární buněčná biologie. 16 (9): 568–576. doi:10.1038 / nrm4014. hdl:10044/1/31281. ISSN  1471-0080. PMID  26081612.
  8. ^ A b C d E F G h i j k l m n Marillonnet, Sylvestre; Werner, Stefan (01.01.2015). "Sestavení vícegenních konstruktů pomocí klonování Golden Gate". Metody v molekulární biologii. 1321: 269–284. doi:10.1007/978-1-4939-2760-9_19. ISBN  978-1-4939-2759-3. ISSN  1940-6029. PMID  26082229.
  9. ^ Werner S, Engler C, Weber E, Gruetzner R, Marillonnet S.Bioeng Bugs. 2012 1. ledna; 3 (1): 38-43.
  10. ^ A b C d E F Sarrion-Perdigones, Alejandro; Falconi, Erica Elvira; Zandalinas, Sara I .; Juárez, Paloma; Fernández-del-Carmen, Asun; Granell, Antonio; Orzaez, Diego (07.07.2011). „GoldenBraid: Iterativní klonovací systém pro standardizované sestavení opakovaně použitelných genetických modulů“. PLOS ONE. 6 (7): e21622. Bibcode:2011PLoSO ... 621622S. doi:10.1371 / journal.pone.0021622. ISSN  1932-6203. PMC  3131274. PMID  21750718.
  11. ^ Pascal Püllmann, Chris Ulpinnis, Sylvestre Marillonnet, Ramona Gruetzner, Steffen Neumann (2019-07-29), „Golden Mutagenesis: Efektivní multi-site-saturation mutagenesis přístup klonováním Golden Gate s automatizovaným designem primerů“, Vědecké zprávy (v němčině), 9 (1), s. 1–11, Bibcode:2019NatSR ... 910932P, doi:10.1038 / s41598-019-47376-1, ISSN  2045-2322, PMC  6662682, PMID  31358887CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)