Specifikace Ectoderm - Ectoderm specification

v Xenopus laevis, specifikace tří zárodečných vrstev (endoderm, mezoderm a ektoderm ) se vyskytuje na blastula etapa.[1] Bylo vyvinuto velké úsilí k určení faktorů, které určují endoderm a mezoderm. Na druhou stranu je zapotřebí jen několik příkladů genů ektoderm specifikace byly popsány v posledním desetiletí. První identifikovanou molekulou potřebnou pro specifikaci ektodermu byla ubikvitinová ligáza Ektodermin (Ecto, TIF1-y, TRIM33); později bylo zjištěno, že deubikvitinační enzym, FAM / USP9x, je schopen překonat účinky ubikvitinace vyvolané Ectoderminem v Smad4 (Dupont et al., 2009). Byly navrženy dva transkripční faktory ke kontrole genové exprese ektodermálních specifických genů: POU91 / 3. října / 4[2] a FoxIe1 / Xema.[3][4] Nový faktor specifický pro ektoderm, XFDL156, se ukázal jako nezbytný pro potlačení diferenciace mezodermu od pluripotentních buněk.[5]

Proteiny potřebné pro ektodermální specifikaci.

Ektodermin a FAM

Biologická role Ectoderminu a FAM

Protein ektodermin, nejprve identifikovaný v Xenopus embrya, podporuje ektodermální osud a potlačuje tvorbu mezodermu zprostředkovanou signalizací Transformující růstový faktor β (TGFβ) a Kostní morfogenní proteiny (BMP), členové nadrodiny TGFβ.[6] Když se ligandy TGFβ váží na receptory TGFβ, způsobují aktivaci signálních převodníků R-Smads (Smad2, Smad3 ). Smad4 tvoří komplex s aktivovanými R-Smads a aktivuje transkripci specifických genů v reakci na signál TGFβ. Dráha BMP přenáší své signály podobným způsobem, ale prostřednictvím jiných typů R-Smads (Smad1, Smad5 a Smad8 ). Transkripční faktor Smad4 je jediným běžným mediátorem sdíleným mezi oběma cestami TGFβ a BMP.[7] Během specifikace ektodermu je funkce Smad4 regulována ubikvitinací a deubikvitinací prováděnou ektoderminem a FAM. Stav ubikvitinace Smad4 určí, zda je schopen reagovat na signály odvozené z TGFβ a BMP.[6][8] Mělo by být dosaženo rovnováhy aktivity, lokalizace a načasování transduktorů TGFβ a BMP, Smad4, FAM a Ectoderminu, aby bylo možné modulovat genovou expresi genů potřebných pro tvorbu zárodečné vrstvy.

Identifikace ektoderminu a FAM

A cDNA Knihovna ze stádia blastuly žabího embrya byla klonována do RNA expresních plazmidů pro generování syntetické mRNA. Poté byla mRNA injikována do několika Xenopus embrya ve čtyřbuněčném stádiu a podívali se včas blastula embrya pro expanzi oblasti ektodermálního markeru Sox2 a snížení exprese mezodermálního markeru Xbra. Ektodermin byl jedním z 50 klonů, který po injekci do embryí představoval tento fenotyp.[6] Identifikace FAM byla provedena pomocí a siRNA obrazovku najít deubikvitinázy které regulují reakci na TGFβ.

Ektodermin a lokalizace FAM

Ektoderminová mRNA se mateřsky ukládá ve zvířecím pólu vajíčka. V rané fázi blastuly embrya tvoří ektoderminová mRNA a protein gradient, který přechází od zvířecího pólu (nejvyšší koncentrace) dolů do okrajové zóny (nejnižší koncentrace), aby se zabránilo TGFβ a uzlové signály které indukují mezodermu pocházející z rostlinného pólu. Ektoderminová mRNA je obohacena na hřbetní straně embrya a na konci této fáze exprese postupně mizí.[6] Smad4 je ubikvitinován ektoderminem v jádře a exportován do cytoplazmy, kde může být deubikvitinován FAM; tímto způsobem lze Smad4 recyklovat a být opět funkční. Ačkoli v časných embryích neexistuje žádný expresní profil FAM Xenopus„U zebrových ryb je homolog FAM exprimován všudypřítomně ve dvoubuněčném stádiu, ale jak vývoj pokračuje, je exprimován pouze v cefalickém centrálním nervovém systému.[9]

Funkce ektoderminu a FAM

Ektodermin je ubikvitin E3 ligáza, která inhibuje signální dráhy TGFβ a BMP inhibicí Smad4 prostřednictvím ubikvitinace lysinu 519 a také přímou vazbou na fosfo-Smad2.[6][8] Injekce Ecto mRNA do marginální zóny vede k expanzi časného ektodermálního markeru, Sox2, a redukci mezodermálních markerů (Xbra, Eomes, Vent-1, Mix-1 a Mixer). Opak se děje u knockdownových experimentů s Ectoderminem pomocí morfolinové strategie; embrya se stávají citlivějšími na odpověď Activinu, vykazují zvýšení a expanzi exprese mezodermálních specifických genů a snižují expresi neurální ploténky a markeru epidermis (Sox2 a cytokeratin). V souladu s aktivitou uctinerminu závislou na ubikvitin-ligáze na prstu RING je mutant Ecto RING-prst (C97A / C100A) neaktivní z hlediska funkce.[6] Zisk funkce FAM zvyšuje odpovědi z BMP a TGFp a jeho ztrátu funkce mutací v kritickém zbytku, protože jeho aktivita způsobila inhibici odpovědi TGFp.

Zachování ektoderminu a FAM u jiných druhů

Molekulární funkce lidského ektoderminu, který působí jako negativní regulátor Smad4, naznačuje, že tato specifická funkce je mezi liniemi obratlovců zachována.[6] Sekvenční identita mezi FAM homology je vyšší než 90% při srovnání homologů z Xenopus, zebrafish, myš a člověk, což naznačuje, že by to mohlo být také zachováno mezi jinými organismy.[9] Inaktivace knockoutového genu u myších embryí skutečně ukázala, že je zachována funkce ektoderminu jako inhibitoru signalizace TGF-beta.[10] Embrya bez ektoderminu vykazují defektní vývoj předního viscerálního endodermu (AVE), což je první tkáň, která je indukována signály TGF-beta v myších embryích; v souladu se ztrátou inhibitoru vykazovala ektoderminová - / - embrya zvětšenou indukci AVE. Protože AVE je přirozeným zdrojem vylučovaných antagonistů TGF-beta, tato primární expanze AVE způsobila sekundárně, v pozdějších stádiích, inhibici extracelulárních ligandů TGF-beta, což vedlo k tomu, že embrya postrádala vývoj mezodermu. Tento model byl potvrzen zjištěním, že ektoderminová - / - embrya byla zachráněna k divokému typu (normální AVE, normální vývoj mezodermu) snížením genetické dávky hlavního ligandu TGF-beta embrya, Nodalu. Další podpora role jako inhibitoru TGF-beta, tkáňově selektivní delece ektoderminu z epiblastu (ze kterého je odvozen mezoderm, ale nikoli AVE) ponechala AVE nedotčená, ale tentokrát způsobila expanzi předních mezodermálních osudů, což svědčí o zvýšeném citlivost na signály TGF-beta. Souhrnně tato data potvrdila pomocí genetických nástrojů buněčnou autonomní roli ektoderminu jako inhibitoru odpovědí Smad4 dříve identifikovaných u embryí Xenopus a lidských buněčných linií.

FOXI1e

Biologická role FOXI1e

Během raného vývoje v Xenopustranskripční faktor FoxI1e / Xema aktivuje epidermální diferenciaci a potlačuje geny specifické pro endoderm a mezoderm v čepicích zvířat (Suri et al., 2005). Předpokládá se, že FoxI1e je aktivní dříve, než se ektoderm diferencuje na epidermis a centrální nervový systém.

Identifikace FoxI1e

Mir et al., 2005 identifikovali FoxI1e (Xema) výběrem genů, které byly v ektodermě ve srovnání s rostlinnou oblastí raného stádia regulovány pod signály indukujícími mezoderm. blastula embryo. Vysoká exprese tohoto genu byla také pozorována u zvířecích čepic u embryí, kterým chybí VegT ve srovnání s divokým typem.

Lokalizace v buňce

FoxI1e mRNA je exprimována zygoticky (stupeň 8.5) a dosahuje vyšší úrovně exprese na začátku gastrulace a udržuje tuto hladinu v neurule, koncovce až do časných stadií pulce.[4] FoxI1e má zvláštní mozaikový expresní vzor, ​​je exprimován nejprve v hřbetní ektodermě a zatímco gastrula postupuje, exprese prochází ventrální stranou a její exprese je v dorzální straně down-regulovaná, když se formuje neurální deska.[11] FoxI1e je závislý na signálech BMP ve stadiu neurule, což omezuje lokalizaci FoxI1e na ventrální stranu ektodermu.

Funkce a regulace bílkovin

FoxI1e / Xema patří do třídy FoxI1 rodiny transkripčních faktorů vidlicových hlav, o nichž je známo, že se podílejí na tvorbě mezodermu, vývoji očí[12] a specifikace ventrální hlavy.[13] Bylo navrženo, aby Notch a / nebo NODÁLNÍ, vyjádřeno v rostlinné / mezodermové oblasti raného blastula embryo, mohou být potenciálně inhibitory FoxI1e.[3][11]

Ztráta a zisk z funkce

Inhibice zrání mRNA FoxI1e morfolinem blokujícím sestřih ukazuje malformace ve vývoji epidermis a propustného systému a reguluje ectoderm specifické geny, zatímco nadměrná exprese FoxI1e inhibuje tvorbu mezodermu a endodermu. Rostlinné struktury tvoří hmoty pozdní blastuly, které by normálně vedly k endodermu a mezodermu, když jsou injikovány mRNA FoxI1e, jsou schopné exprimovat ektodermální specifické markery (pan-ektodermální E-kadherin, epiteliální cytokeratin, marker neurální lišty Slug a neurální marker Sox- 2) zatímco endodermální markery (endodermin, Xsox17a) poklesly v expresi.[3][4]

XFDL156

Biologická role XFDL156

The p53 protein se váže na promotory časných mezodermálních genů.[14] p53 je mateřsky uložený transkript, který tvoří komplex transkripčních faktorů se Smad2 a řídí expresi genů zapojených do mezodermové indukce a aktivace cílových genů TGFp.[15] The prst zinku (Zn) nukleární protein XFDL159, exprimovaný ve víčku zvířete, působí jako ektodermový faktor, specifikuje ektoderm tím, že inhibuje p53 z aktivace genů pro diferenciaci mezodermu.[5]

Identifikace XFDL156

Konstrukce cDNA knihovny ze zvířecích čepiček ve stádiu 11,5, klonována do expresního vektoru a generována mRNA. Syntetická RNA byla poté injikována do embryí a byla získána víčka zvířat těchto sebraných embryí a podrobena aktivin léčba. Xbra byla získána výběrem klonu, který potlačuje mezodermální marker Xbra.[5]

Lokalizace XFDL156

Protože XFDL156 je faktor, který interaguje s p53, je lokalizace tohoto proteinu v jádře (Sasai et al., 2008). MRNA XFDL156 je uložena mateřsky a poté exprimována zygoticky. Časová osa genové exprese ukazuje vyšší úroveň exprese na počátku gastruly a poloviční pokles exprese na polovině gastruly a ve 20. stupni exprese mizí.[5]

Proteinová funkce XFDL156

XFDR zinkový prst se váže na regulační oblast p53 umístěnou v C-terminální doméně a jeho exprese není ovlivněna přítomností transkripčních faktorů aktivinu, FoxI1e nebo XLPOU91.

Ztráta a zisk z funkce v XFDL156

Ztráta funkce morfolinem způsobuje nesprávnou mezodermální diferenciaci v ektoermálních oblastech; je to způsobeno desupresí mezodermálních markerů (Xbra, VegT a Mix.2). Zisk funkcí způsobuje snížení exprese mezodermálních markerů.[5]

Zachování homologů XFDL u jiných druhů

Lidské a myší homology XFDR156 jsou schopny doplňovat funkci XFDR při interakci s p53 a inhibovat jej, aby působil jako transkripční faktor.[5]

  • Indukce ektodermy v časné blastule v Xenopus embryo.

Reference

  1. ^ Heasman, J., Quarmby, J. a Wylie, C.C. (1984). Mitochondriální mrak oocytů Xenopus: zdroj materiálu zárodečných granulí. Dev Biol 105, 458-469.
  2. ^ Snir, M., Ofir, R., Elias, S. a Frank, D. (2006). Protein Xenopus laevis POU91, homolog Oct3 / 4, reguluje přechod kompetence z mezodermu do osudu nervových buněk. EMBO J 25, 3664-3674.
  3. ^ A b C Mir, A., Kofron, M., Zorn, A.M., Bajzer, M., Haque, M., Heasman, J. a Wylie, C.C. (2007). FoxI1e aktivuje tvorbu ektodermu a řídí pozici buněk v blastule Xenopus. Development 134, 779-788.
  4. ^ A b C Suri, C., Haremaki, T. a Weinstein, D.C. (2005). K potlačení mesendodermu je nutný Xema, gen třídy foxi exprimovaný v gastrulovém stadiu Xenopus ectoderm. Development 132, 2733-2742.
  5. ^ A b C d E F Sasai, N., Yakura, R., Kamiya, D., Nakazawa, Y. a Sasai, Y. (2008). Ektodermální faktor omezuje diferenciaci mezodermu inhibicí p53. Cell 133, 878-890.
  6. ^ A b C d E F G Dupont, S., Zacchigna, L., Cordenonsi, M., Soligo, S., Adorno, M., Rugge, M. a Piccolo, S. (2005). Specifikace zárodečné vrstvy a kontrola buněčného růstu pomocí Ectoderminu, ubikvitinové ligázy Smad4. Cell 121, 87-99.
  7. ^ Siegel, P.M. a Massague, J. (2003). Cytostatické a apoptotické účinky TGFβeta na homeostázu a rakovinu. Recenze přírody - Cancer 3, 807-821.
  8. ^ A b Dupont, S., Mamidi, A., Cordenonsi, M., Montagner, M., Zacchigna, L., Adorno, M., Martello, G., Stinchfield, MJ, Soligo, S., Morsut, L., et al. (2009). FAM / USP9x, deubikvitinační enzym nezbytný pro signalizaci TGFpeta, řídí monadikvitaci Smad4. Cell 136, 123-135.
  9. ^ A b Khut, P.Y., Tucker, B., Lardelli, M. a Wood, S.A. (2007). Evoluční a expresní analýza zebrafish deubiquitylating enzymu, usp9. Zebrafish 4, 95-101.
  10. ^ Morsut L, Yan KP, Enzo E, Aragona M, Soligo SM, Wendling O, Mark M, Khetchoumian K, Bressan G, Chambon P, Dupont S, Losson R, Piccolo S (2010). „Negativní kontrola aktivity Smad ektoderminem / Tif1gamma vytváří savčí embryo“. Rozvoj. 137 (15): 2571–8. doi:10.1242 / dev.053801. PMID  20573697.
  11. ^ A b Mir, A., Kofron, M., Heasman, J., Mogle, M., Lang, S., Birsoy, B. a Wylie, C. (2008). Signály dlouhého a krátkého dosahu řídí dynamickou expresi genu specifického pro hemisféru zvířat v Xenopus. Dev Biol 315, 161-172.
  12. ^ Pohl, B.S., Rossner, A. a Knochel, W. (2005). Rodina genů Fox v Xenopus laevis: FoxI2, FoxM1 a FoxP1 v raném vývoji. Int J Dev Biol 49, 53-58.
  13. ^ Matsuo-Takasaki, M., Matsumura, M. a Sasai, Y. (2005). Podstatná role Xenopus Foxi1a pro ventrální specifikaci hlavového ektodermu během gastrulace. Development 132, 3885-3894.
  14. ^ Cordenonsi, M., Dupont, S., Maretto, S., Insinga, A., Imbriano, C. a Piccolo, S. (2003). Vazby mezi nádorovými supresory: p53 je vyžadován pro odpovědi genu TGFβeta ve spolupráci se Smads. Buňka 113, 301-314.
  15. ^ Takebayashi-Suzuki, K., Funami, J., Tokumori, D., Saito, A., Watabe, T., Miyazono, K., Kanda, A. a Suzuki, A. (2003). Souhra mezi tumor supresorem p53 a TGF beta signalizací formuje osy embryonálního těla v Xenopus. Development 130, 3929-3939.