Kolokalizace - Colocalization
v fluorescenční mikroskopie, kolokalizace "Pozorování prostorového překrytí" označuje pozorování prostorového překrytí mezi dvěma (nebo více) různými fluorescenčními značkami, z nichž každá má samostatnou emisní vlnovou délku, aby se zjistilo, zda jsou různé "cíle" umístěny ve stejné oblasti buňky nebo velmi blízko sebe. Definici lze rozdělit na dva různé jevy, společný výskyt, který se týká přítomnosti dvou (možná nesouvisejících) fluoroforů ve stejném pixelu, a korelace, což je mnohem významnější statistický vztah mezi fluorofory, které svědčí o biologické interakci.[1] Tato technika je důležitá pro mnoho buněčných biologických a fyziologických studií během demonstrace vztahu mezi páry biologických molekul.
Dějiny
Schopnost prokázat korelaci mezi dvojicí biomolekul výrazně vylepšil Erik Manders z Amsterdamské univerzity, který představil Pearsonův korelační koeficient mikroskopům,[2] spolu s dalšími koeficienty, z nichž se nejpopulárnější a nejužitečnější ukázaly „překrývající se koeficienty“ M1 a M2.[3][4] Účelem použití koeficientů je charakterizovat míru překrytí mezi obrazy, obvykle dvěma kanály v multidimenzionálním mikroskopickém obrazu zaznamenaném při různých emisních vlnových délkách. Populární přístup představil Sylvain Costes, který využil Pearsonův korelační koeficient jako nástroj pro objektivní stanovení prahových hodnot požadovaných M1 a M2.[5] Přístup Costes předpokládá, že jsou zajímavé pouze pozitivní korelace, a neposkytuje užitečné měření PCC.
Ačkoli použití koeficientů může významně zlepšit spolehlivost detekce kolokalizace, záleží na řadě faktorů, včetně podmínek, jak byly připraveny vzorky s fluorescencí a jak byly získány a zpracovány obrazy s kolokalizací. Studie by měly být prováděny s velkou opatrností a po pečlivém přečtení. V současné době je pole pronásledováno nejasnostmi a standardizovaný přístup je třeba ještě pevně stanovit.[6] Pokusy o nápravu zahrnují přezkoumání a revizi některých koeficientů,[7][8] použití faktoru pro korekci hluku,[1] "Korekce založené na replikaci šumu pro přesné měření kolokalizace".[9] a návrh dalších protokolů,[10] které důkladně přezkoumali Bolte a Cordelieres (2006).[6] Kromě toho vzhledem k tendenci fluorescenčních obrazů obsahovat určité množství signálu mimo zaostření a poissonově záběru a dalšímu šumu obvykle vyžadují před kvantifikací předběžné zpracování.[11][12] Pečlivá obnova obrazu dekonvolucí odstraňuje šum a zvyšuje kontrast v obrazech, což zlepšuje kvalitu výsledků kolokalizační analýzy. Až dosud nejčastěji používané metody pro kvantifikaci kolokalizace počítají statistickou korelaci intenzit pixelů ve dvou odlišných mikroskopických kanálech. Novější studie ukázaly, že to může vést k vysokým korelačním koeficientům i pro cíle, o nichž je známo, že se nacházejí v různých buněčných kompartmentech.[13] Silnější kvantifikace kolokalizace lze dosáhnout kombinací digitálního rozpoznávání objektů, výpočtu překrytí oblasti a kombinace s hodnotou korelace intenzity pixelu. To vedlo ke konceptu Pearsonova korelačního koeficientu s korekcí objektu.[13]
Příklady použití
Některá nepropustná fluorescenční barviva zinku mohou detekovatelně značit cytosol a jádra z apoptizující a nekrotizující buněk mezi každým ze čtyř různých zkoumaných typů tkání. Jmenovitě: mozková kůra, hipokampus, mozeček a bylo také prokázáno, že kolokalizovaná detekce zvýšení zinku a dobře přijímaný indikátor buněčné smrti propidium jodid vyskytly se také v ledvinových buňkách. Využití principů fluorescenční kolokalizace. byla prokázána náhodná detekce akumulace zinku a absorpce propidium jodidu (tradiční indikátor buněčné smrti) v různých typech buněk.[14] V přehledu lze najít různé příklady kvantifikace kolokalizace v oblasti neurovědy.[15] Podrobné protokoly o kvantifikaci kolokalizace lze najít v kapitole knihy.[16]
Rozlišení jedné molekuly
Kolokalizace se používá ve fluorescenční mikroskopii s jednou molekulou v reálném čase k detekci interakcí mezi fluorescenčně značenými molekulárními druhy. V tomto případě je jeden druh (např. Molekula DNA) typicky imobilizován na zobrazovacím povrchu a druhý druh (např. Protein vázající DNA) je dodáván do roztoku. Tyto dva druhy jsou označeny barvivy spektrálně rozlišených (> 50 nm) barev, např. kyanin-3 a kyanin-5. Fluorescenční excitace se obvykle provádí v režimu úplného vnitřního odrazu, který zvyšuje poměr signál-šum pro molekuly na povrchu vzhledem k molekulám v hromadném roztoku. Molekuly jsou detekovány jako skvrny objevující se na povrchu v reálném čase a jejich umístění je zjištěno v rozmezí 10-20 nm přizpůsobením funkcí šíření bodů. Protože typické velikosti biomolekul jsou řádově 10 nm, je tato přesnost obvykle dostatečná pro vyvolání molekulárních interakcí [17]
Interpretace výsledků
Pro účely lepší interpretace výsledků kvalitativních a kvantitativních kolokalizačních studií bylo navrženo použít soubor pěti jazykových proměnných vázaných na hodnoty kolokačních koeficientů, jako např. velmi slabá, slabý, mírný, silný, a velmi silnýza jejich popis. Tento přístup je založen na použití modelu fuzzy systému a počítačové simulace. Když jsou zavedeny nové koeficienty, lze jejich hodnoty přizpůsobit sadě.[18]
Související techniky
- Försterův přenos rezonanční energie (FRET): blízkost 10 nm
- (Světelná mikroskopie: rozlišení pouze 250 nm; žádná jistota účinné interakce)
- Rozbalovací nabídky / rozbalovací nabídky imuno srážek (IP)
- Mapování interakce hybrid - kvasnice 2 - protein
Srovnávací obrázky
Stupeň kolokalizace na obrázcích fluorescenční mikroskopie lze ověřit pomocí Zdroj srovnávací kolokace, bezplatná kolekce sad obrázků ke stažení s předdefinovanými hodnotami kolokalizace.
Softwarové implementace
otevřený zdroj
- FIJI je pouze ImageJ - včetně baterií
- BioImage XD
uzavřený zdroj
- AxioVision Colocalization Module
- Software pro výzkum kolokalizace
- CoLocalizer Pro CoLocalizer Pro
- Kolonizační modul Nikon NIS-Elements
- Vědecký objemový zobrazovací analyzátor kolokace Huygens
- Rychlost kvora technologie
- Image-Pro společnosti Media Cybernetics
- Bitplane's Imaris
- arivis Vision4D
Reference
- ^ A b Adler et al. (2008)
- ^ Manders a kol. (1992). „Dynamika trojrozměrných replikačních vzorů během S-fáze, analyzovaná dvojitým značením DNA a konfokální mikroskopií.“ [1]
- ^ Mandery; et al. (1993). "Měření společné lokalizace objektů na dvoubarevných konfokálních obrázcích". Journal of Microscopy. 169 (3): 375–382. doi:10.1111 / j.1365-2818.1993.tb03313.x.
- ^ Zinchuk V et al (2007). "Kvantitativní kolokalizační analýza vícebarevných konfokálních obrazů imunofluorescenční mikroskopie: tlačení pixelů pro zkoumání biologických jevů". Acta Histochem Cytochem 40:101-111.
- ^ Costes et al (2004) „Automatické a kvantitativní měření kolokalizace proteinů-proteinů v živých buňkách.“ [2]
- ^ A b BOLTE a CORDELIÈRES (2006) „Prohlídka subcelulární kolokalizační analýzy ve světelné mikroskopii.“ [3]
- ^ Adler a Parmryd (2010) „Kvantifikace kolokalizace korelací: Pearsonův korelační koeficient je lepší než Manderův koeficient překrytí.“ [4]
- ^ Krauß et al (2015). „Kolokalizace fluorescence a Ramanovy mikroskopické obrazy pro identifikaci subcelulárních kompartmentů: validační studie.“ Analytik, svazek 140, číslo 7, strany 2360-2368. [5]
- ^ Adler, J .; Pagakis, S.N .; Parmryd, I. (1. dubna 2008). "Korekce korelace na základě šumu na základě replikace pro přesná měření kolokalizace". Journal of Microscopy. 230 (1): 121–133. doi:10.1111 / j.1365-2818.2008.01967.x. PMID 18387047.
- ^ Curr Protoc Cell Biol „Kvantitativní kolokační analýza konfokálních fluorescenčních mikroskopických obrazů.“ Archivováno 2009-11-28 na Wayback Machine
- ^ Pawley JB (2006). Příručka biologické konfokální mikroskopie
- ^ Zinchuk V et al (2011). "Kvantifikace prostorových korelací fluorescenčních markerů pomocí vylepšené redukce pozadí s indexem blízkosti proteinu a odhady korelačního koeficientu". Nat Protoc 6:1554-1567.
- ^ A b Moser, Bernhard; Hochreiter, Bernhard; Herbst, Ruth; Schmid, Johannes A. (01.07.2016). „Analýzu fluorescenční kolokační mikroskopie lze zlepšit kombinací rozpoznávání objektů s korelací intenzity pixelů“. Biotechnology Journal. 12 (1): 1600332. doi:10.1002 / biot.201600332. ISSN 1860-7314. PMC 5244660. PMID 27420480.
- ^ Stork, Christian J .; Li, Yang V. (15. září 2006). "Měření životaschopnosti buněk pomocí membránově nepropustného zinkového fluorescenčního indikátoru". Journal of Neuroscience Methods. 155 (2): 180–186. doi:10.1016 / j.jneumeth.2005.12.029. PMID 16466804.
- ^ Zinchuk V & Grossenbacher-Zinchuk O (2009). „Nedávný pokrok v kvantitativní kolokalizační analýze: Zaměření na neurovědu“. Prog Histochem Cytochem 44:125-172
- ^ „Adler J & Parmryd I (2013) Methods Mol Biol 931, 97-109“. Kolokalizační analýza ve fluorescenční mikroskopii. Citováno 2016-04-19.
- ^ Gelles, Friedman L. (17. února 2012). „Mechanismus iniciace transkripce u aktivátora závislého na aktivátoru definovaném pozorováním jedné molekuly“. Buňka. 148 (4): 635–637. doi:10.1016 / j.cell.2012.01.018. PMC 3479156. PMID 22341441.
- ^ Zinchuk, V; et al. (2013). „Překlenutí propasti mezi kvalitativními a kvantitativními výsledky kolokalizace ve studiích fluorescenční mikroskopie“. Sci Rep. 3: 1365. doi:10.1038 / srep01365. PMC 3586700. PMID 23455567.