Genová exprese cap analýzy - Cap analysis gene expression

Genová exprese cap analýzy (KLEC) je genová exprese technika používaná v molekulární biologii k vytvoření snímku 5 'konce messenger RNA populace v biologickém vzorku ( přepis ). Malé fragmenty (historicky 27 nukleotidy dlouhý, ale nyní omezený pouze sekvenčními technologiemi) od samých počátků mRNA (5 'konce roku 2006) limitován přepisy) jsou extrahovány, zpětně přepsaný k DNA, PCR zesílený a seřazeno. CAGE poprvé publikovali Hayashizaki, Carninci a spolupracovníci v roce 2003.[1]CAGE byl široce používán v rámci FANTOM výzkumné projekty.

Analýza

Výstupem z CAGE je sada krátkých nukleotidových sekvencí (často nazývaných) značky) s jejich pozorovanými počty.

Pomocí referenčního genomu může výzkumník s jistotou určit originál mRNA (a tedy které gen ) značka byla extrahována z.

Počet kopií značek CAGE poskytuje snadný způsob digitální kvantifikace množství transkriptů RNA v biologických vzorcích.

Na rozdíl od podobné techniky sériová analýza genové exprese (SAGE, superSAGE), ve kterém značky pocházejí z jiných částí přepisů, se CAGE používá především k vyhledání přesných transkripce spusťte stránky v genomu. Tyto znalosti zase umožňují výzkumníkovi zkoumat promotér struktura nezbytná pro genovou expresi.

Protokol CAGE má však známé zkreslení s nespecifickým guanin (G) nanejvýš na 5 'konci značek CAGE, což se připisuje 5'-prodloužení bez šablony během prvního řetězce cDNA syntéza.[2] To by vyvolalo chybné mapování značek CAGE, například na nepřepisované pseudogeny.[2] Na druhou stranu bylo toto přidání Gs také použito jako signál k filtrování spolehlivějších vrcholů TSS.[3]

Dějiny

Původní metoda CAGE (Shiraki et al., 2003)[1] používal CAP Trapper[4] pro zachycení 5 'konců, oligo-dT primerů pro syntézu cDNA, restrikční enzym typu IIs MmeI pro štěpení značek a Sangerova metoda za jejich řazení.

Náhodné primery pro reverzní transkripci byly zavedeny v roce 2006 společností Kodzius et al.[5] pro lepší detekci nepolyadenylovaných RNA.

v DeepCAGE (Valen et al., 2008),[6] concatemers tagů byly sekvenovány s vyšší propustností na 454 “další generace”Platforma pro sekvenování.

V roce 2008 byl do protokolu DeepCAGE (Maeda et al., 2008).[7]

v nanoKÁZA (Plessy et al., 2010),[8] 5 'konce nebo RNA byly zachyceny metodou přepínání templátů místo CAP Trapper, aby bylo možné analyzovat menší počáteční množství celkové RNA. Delší štítky byly štěpeny restrikční enzym typu III EcoP15I a přímo sekvenován na Solexa (pak Illumina) platforma bez zřetězení.

The CAGEscan metodologie (Plessy et al., 2010),[8] kde je přeskočeno štěpení enzymatického tagu a sekvenováno 5 'cDNA spárovaný konec, byl představen ve stejném článku k připojení nových promotorů ke známým anotacím.

S HeliScopeCAGE (Kanamori-Katayama et al., 2011),[9] protokol CAP-trapped CAGE byl změněn tak, aby přeskočilo štěpení enzymatické značky a sekvenci přímo na zakončených 5 'koncích HeliScope platforma, bez amplifikace PCR. To pak automatizoval Itoh et al.[10] v roce 2012.

V roce 2012 standardní protokol CAGE aktualizoval Takahashi et al.[11] štěpit značky pomocí EcoP15I a řadit je na platformě Illumina-Solexa.

V roce 2013 Batut et al.[12] kombinovaný CAP trapper, přepínání templátů a digesce exonukleázy závislou na 5'-fosfátu v RAMPAGE maximalizovat specificitu promotoru.

V roce 2014 Murata et al.[13] zveřejnil nAnTi-CAGE protokol, kde jsou zakončené 5 'konce sekvenovány na platformě Illumina bez amplifikace PCR a bez štěpení značky.

V roce 2017 Poulain et al.[14] aktualizoval nanoKÁZA protokol k použití značení metoda (na základě Transpozice Tn5 ) pro multiplexování.

V roce 2018 Cvetesic et al.[15] zvýšil citlivost CAP zachyceného CAGE zavedením selektivně odbouratelné nosné RNA (SLIC-CAGE, „Super-Low Input Carrier-CAGE“).

Viz také

Reference

  1. ^ A b Shiraki, T; Kondo, S; Katayama, S; et al. (2003-12-23). "Cap analýza genové exprese pro vysoce výkonnou analýzu transkripčního výchozího bodu a identifikaci využití promotoru". Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26): 15776–81. Bibcode:2003PNAS..10015776S. doi:10.1073 / pnas.2136655100. PMC  307644. PMID  14663149.
  2. ^ A b Zhao, Xiaobei (2011). „Systematické seskupování transkripcí Krajiny startovacího webu“. PLOS ONE. 6 (8): e23409. Bibcode:2011PLoSO ... 623409Z. doi:10.1371 / journal.pone.0023409. PMC  3160847. PMID  21887249.
  3. ^ Cumbie, Jason (2015). „NanoCAGE-XL a CapFilter: přístup k identifikaci počátečních míst transkripce s vysokou spolehlivostí v širokém genomu“. BMC Genomics. 16: 597. doi:10.1186 / s12864-015-1670-6. PMC  4534009. PMID  26268438.
  4. ^ Carninci, Piero (1996). "Vysoce účinné klonování cDNA v plné délce pomocí biotinylovaného CAP lapače". Genomika. 37 (3): 327–36. doi:10.1006 / geno.1996.0567. PMID  8938445.
  5. ^ Kodzius, Rimantas (2006). "CAGE: cap analýza genové exprese". Nat metody. 3 (3): 211–22. doi:10.1038 / nmeth0306-211. PMID  16489339.
  6. ^ Valen, Eivind (2009). „Detekce a analýza genových promotorů hipokampu v celém genomu pomocí DeepCAGE“. Genome Res. 19 (2): 255–265. doi:10.1101 / gr.084541.108. PMC  2652207. PMID  19074369.
  7. ^ Maeda, Norihiro (2008). „Vývoj metody značení DNA čárovým kódem pro monitorování dynamických změn v genové expresi pomocí ultra vysoce výkonného sekvenceru“. Biotechniky. 45 (1): 95–7. doi:10.2144/000112814. PMID  18611171. Citováno 2016-04-28.
  8. ^ A b Plessy, Charles (2010). „Detekce v celém genomu a analýza hlavních promotorů hipokampu pomocí DeepCAGE“. Nat metody. 7 (7): 528–34. doi:10.1038 / nmeth.1470. PMC  2906222. PMID  20543846.
  9. ^ Kanamori-Katayama, Mutsumi (2011). „Unnamplified cap analysis of gene expression on a single-molecule sequencer“. Genome Res. 21 (7): 1150–9. doi:10.1101 / gr.115469.110. PMC  3129257. PMID  21596820.
  10. ^ Itoh, Masayoshi (2012). "Automatizovaný pracovní postup pro přípravu cDNA pro analýzu cap genové exprese na jednomolekulovém sekvenceru". PLOS ONE. 7 (1): e30809. Bibcode:2012PLoSO ... 730809I. doi:10.1371 / journal.pone.0030809. PMC  3268765. PMID  22303458.
  11. ^ Takahashi, Hazuki (2012). „Profilování exprese na 5 'konci pomocí genové exprese cap-analysis a sekvenování nové generace“. Nat Protoc. 7 (3): 542–61. doi:10.1038 / nprot.2012.005. PMC  4094379. PMID  22362160.
  12. ^ Batut, Philippe (2013). „Profilování vysoce věrných promotorů odhaluje rozšířené alternativní využití promotorů a expresi vývojových genů na základě transposonu“. Genome Res. 23 (1): 169–80. doi:10,1101 / gr.139618.112. PMC  3530677. PMID  22936248.
  13. ^ Murata, Mitsuyoshi (2014). "Detekce expresních genů pomocí CAGE". Regulační sítě transkripčních faktorů. Metody v molekulární biologii. 1164. str. 67–85. doi:10.1007/978-1-4939-0805-9_7. ISBN  978-1-4939-0804-2. PMID  24927836.
  14. ^ Poulain, Stéphane (2017). NanoCAGE: Metoda pro analýzu kódování a nekódování 5'-zakončených transkriptomů. Metody v molekulární biologii. 1543. str. 57–109. doi:10.1007/978-1-4939-6716-2_4. ISBN  978-1-4939-6714-8. PMID  28349422.
  15. ^ Cvetesic, Nevena (2018). „SLIC-CAGE: transkripce počátečního mapování transkripce s vysokým rozlišením pomocí nanogramových úrovní celkové RNA“. Výzkum genomu. 28 (12): 1943–1956. doi:10,1101 / gr.235937.118. PMC  6280763. PMID  30404778.

externí odkazy