Blot (biologie) - Blot (biology)

A skvrna, v molekulární biologie a genetika, je metoda přenosu bílkoviny, DNA nebo RNA na nosič (například a nitrocelulóza, polyvinylidenfluorid nebo nylon membrána). V mnoha případech se to provádí po a Gelová elektroforéza, přenos molekul z gelu na blotovací membrána a jindy přidáním vzorků přímo na membránu. Po blotování se přenesené proteiny, DNA nebo RNA poté vizualizují barvením barvivem (například barvením proteinů stříbrem), autoradiografické vizualizace radioaktivně značené molekuly (prováděné před blotem) nebo specifické značení některých proteinů nebo nukleové kyseliny. Ten je hotový s protilátky nebo hybridizační sondy které se vážou pouze na některé molekuly skvrny a mají enzym připojil se k nim. Po správném promytí je tato enzymatická aktivita (a tedy i molekuly, které hledáme ve skvrně) vizualizována inkubací se správnou reaktivitou, čímž se na skvrně vytvoří buď barevný depozit, nebo chemiluminiscenční reakce, která je registrována fotografem film.

Southern blot

A Southern blot je metoda běžně používaná v molekulární biologii pro detekci konkrétního DNA sekvence ve vzorcích DNA. Southern blotting kombinuje přenos fragmentů DNA oddělených elektroforézou na filtrační membránu a následnou detekci fragmentů hybridizací sondy.^[1]

Western blot

A western blot se používá k detekci specifických proteinů ve složitých vzorcích. Proteiny jsou nejprve odděleny podle velikosti pomocí elektroforézy, než jsou přeneseny na vhodné blotovací matice (obvykle polyvinylidenfluorid nebo nitrocelulóza ) a následná detekce pomocí protilátek.

Far-western blot

Podobně jako a western blot, far-western blot používá interakce protein-protein detekovat přítomnost specifického proteinu imobilizovaného na blotovací matrici. Protilátky se poté používají k detekci přítomnosti komplexu protein-protein, což činí Far-Western blot specifickým případem Western blotu.

Jihozápadní skvrna

A jihozápadní skvrna je založeno na Southern blot a používá se k identifikaci a charakterizaci proteinů vázajících DNA podle jejich schopnosti vázat se na specifické oligonukleotidové sondy.^[2] Proteiny se oddělí gelovou elektroforézou a následně se přenesou na nitrocelulózové membrány podobně jako jiné typy blotování.

Východní blot

The východní skvrna se používá k detekci specifických posttranslačních modifikací proteinů. Proteiny jsou odděleny gelovou elektroforézou před přenesením do blotovací matrice, načež jsou detekovány posttranslační modifikace specifickými substráty (toxin cholery, konkanavalin, fosfomolybdenan atd.) Nebo protilátkami.^[3]

Dálného východu blot

The Dálného východu blot je pro detekci lipidově vázaného oligosacharidy. Vysoce účinná tenkovrstvá chromatografie se nejprve používá k oddělení lipidů fyzikálními a chemickými charakteristikami, poté se přenese do blotovací matice, než se oligosacharidy detekují specifickým vazebným proteinem (tj. protilátkami nebo lektiny).

Northern blot

The severní skvrna je pro detekci specifických sekvencí RNA ve složitých vzorcích. Northern blot nejprve odděluje vzorky podle velikosti gelovou elektroforézou, než se přenesou do blotovací matrice a detekují se značenými sondami RNA.

Reverzní severní skvrna

The reverzní Northern blot se liší od severního i jižního blotu tím, že DNA je nejprve imobilizována na blotovací matrici a specifické sekvence jsou detekovány značenými sondami RNA.

Dot blot

A dot blot je speciální případ kteréhokoli z výše uvedených blotů, kdy se analyt přidává přímo do blotovací matice (a jeví se jako „tečka“), na rozdíl od oddělení vzorku elektroforézou před blotováním.

Seznam blotů

• Southern blot pro DNA
• severní skvrna pro RNA
• reverzní Northern blot pro RNA
• western blot pro bílkoviny
• far-western blot pro interakce protein-protein
• východní skvrna pro posttranslační modifikace
• Dálného východu blot pro glykolipidy
• dot blot

Viz také

• Imunoscreening

Reference