BacMam - BacMam - Wikipedia

Člověk mezenchymální kmenová buňka exprimující fúzi proteinu spojenou s mikrotubuly do Zelený fluorescenční protein (zelená) a fúze histonu 2b s tagRFP (červená) pomocí technologie dodávání genů BacMam.

Baculovirus genový přenos do Mammalianské buňky, známé z článků vědeckého výzkumu jako BacMam, je použití bakulovirus dodat geny na savčí buňky.[1][2] Bakuloviry jsou viry hmyzích buněk, které lze modifikovat tak, aby exprimovaly proteiny v savčích buňkách. Nemodifikovaný bakulovirus je schopen vstoupit do savčích buněk, avšak jeho geny nejsou exprimovány, pokud není rozpoznatelný savcem promotér je začleněn před upřednostňovaným genem. Jak nemodifikovaný baculovirus, tak baculovirus modifikovaný savčím promotorem (BacMam) nejsou schopné replikovat se u lidí, a proto nejsou infekční.

Vynalezl Dr. Frederick M. Boyce,[3] BacMam je bakulovirem zprostředkovaná technika přenosu genů, která si získala široké použití kvůli výhodám ve srovnání s jinými transfekce metody ((recenze viz Kost, T.A. et al,[4][5][6]). Kromě toho bylo zjištěno, že BacMam má inherentní flexibilitu oproti stabilní buněčné linie,[7] což přispělo k jeho přijetí jako standardní techniky přenosu genů.

Obecné vlastnosti

Technologie dodávání genů BacMam je přechodný expresní systém, který usnadňuje expresi toxických genových produktů. Má širokou škálu transdukce včetně mnoha primárních typů buněk a kmenové buňky.[8] Bakulovirový genom má velkou kapacitu pro vložení cizího genu, až 38 kb byly úspěšně vyzkoušeny.[9] Je možné simultánní dodání více genů do stejné buňky.[10] Existují malé až žádné mikroskopicky pozorovatelné cytopatické účinky částic BacMam na buňky savců.[11] Úroveň genové exprese může být upravena dávkou viru nebo chemickými přísadami s použitím inhibitorů histon-deacetylázy.[12] Transdukce buněk se provádí pouze přidáním kapaliny, a proto je BacMam přístupný automatizovaným metodám. Nakonec jsou viry stabilní, pokud jsou dlouhodobě skladovány ve tmě při 4 ° C.[13]

Úvahy o biologické bezpečnosti[14][15]

Baculoviry jsou látky rizikové skupiny 1, které se pro hmyzí buňky široce používají již více než 25 let produkce bílkovin aplikace.[16] Baculoviry jsou produkovány v hmyzích buňkách a nejsou schopné replikace v savčích buňkách a není známo, že by způsobovaly onemocnění u zdravých dospělých lidí. Viry BacMam jsou navíc inaktivovány lidským doplňkem, což snižuje riziko pro výzkumné pracovníky. A konečně, viry používané v laboratoři se nemohou replikovat v hmyzu, takže nehrozí nebezpečí pro životní prostředí z náhodného uvolnění těchto částic do prostředí.

Virová vstup

Studie o vstupu bakuloviru na člověka hepatocelulární karcinom buňky naznačují, že BacMam vstupuje do savčích buněk prostřednictvím klatrinem zprostředkované endocytózy a případně prostřednictvím makropinocytózy.[17] Další studie naznačují, že jeskyně jsou nějakým způsobem zapojeny do vstupu bakuloviru do savčích buněk.[18]

Odpověď hostitelské buňky

Aby byla technologie dodávání genů účinná, nesmí zasahovat do normální buněčné funkce. Cytotoxicita testy a transkriptomové analýzy na člověku HEK buňka linie (HEK293) odhalily, že bakulovirová transdukce není cytotoxická a neindukuje diferenciální transkripční reakce.[19] Podobně infikovaní Schwannovy buňky si zachovávají své charakteristické morfologické a molekulární vlastnosti fenotyp a jsou schopné diferenciace in vitro a exprimují P0 myelinizace popisovač. Použitím komplementární DNA (cDNA) technologie microarray ke zkoumání in vitro a in vivo globální profily exprese buněčných genů v mozku potkana, kultivovaný člověk astrocyty a lidské neuronální buňky po virové transdukci byly pozorovány antivirové reakce hostitele.[20] Příbuzné geny byly hlavně ty, které souvisejí s vrozenou imunitou, včetně několika zúčastněných genů Mýtný receptor signální dráha a cytokin interakce -cytokinového receptoru.

  • Bioprodukce
BacMam se používá k produkci bílkovin ve velkém množství pomocí buněk HEK293 v a bioreaktor z dutých vláken Systém[21]
  • Vysoce výkonné prověřování
Farmakologie receptoru spřaženého s G proteinem je umožněna použitím technologie BacMam v objev drog aplikace[22]
  • Fluorescenční mikroskopie
Reagencie pro značení organel jsou komerčně dostupné částice BacMam pro značení organel a dalších subcelulárních struktur[23]
Jeden mitochondrie značený mitochondriálním cíleným zeleným fluorescenčním proteinem[24]
  • Aktivace receptoru / analýza dráhy
Charakterizace aktivace serotoninového receptoru prostřednictvím BacMam dodala fúzi GFP na kinázový substrát[25]
  • Strukturní biologie
Systém BacMam byl použit pro výrobu rozpustných a membránových glykoproteinů pro strukturní studie[26]

Viz také

Reference

  1. ^ Hofmann, C; Strauss, M (1998). „Přenos genu zprostředkovaný bakulovirem v přítomnosti lidského séra nebo krve usnadněný inhibicí systému komplementu“. Genová terapie. 5 (4): 531–536. doi:10.1038 / sj.gt.3300607. PMID  9614578.
  2. ^ Boyce, FM; Bucher, NL (1996). „Baculovirem zprostředkovaný přenos genů do savčích buněk“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 93 (6): 2348–52. doi:10.1073 / pnas.93.6.2348. PMC  39799. PMID  8637876.
  3. ^ US patent č. 5 871 986
  4. ^ Kost, T; Condreay, JP (2002). "Rekombinantní bakuloviry jako vektory pro dodávání genů savčích buněk". Trendy v biotechnologii. 20 (4): 173–180. doi:10.1016 / S0167-7799 (01) 01911-4. PMID  11906750.
  5. ^ Kost, Thomas A; Condreay, J Patrick; Jarvis, Donald L (2005). „Baculovirus jako univerzální vektory pro expresi proteinu v buňkách hmyzu a savců“. Přírodní biotechnologie. 23 (5): 567–575. doi:10.1038 / nbt1095. PMC  3610534. PMID  15877075.
  6. ^ Kost, T; Condreay, J; Ames, R; Rees, S; Romanos, M (2007). "Implementace technologie dodávání genů viru BacMam v prostředí objevu léků". Objev drog dnes. 12 (9–10): 396–403. doi:10.1016 / j.drudis.2007.02.017. PMID  17467576.
  7. ^ Davenport, Elizabeth A .; Nuthulaganti, Parvathi; Ames, Robert S. (2009). BacMam: Všestranná technologie dodávání genů pro testy GPCR. Metody v molekulární biologii. 552. 199–211. doi:10.1007/978-1-60327-317-6_14. ISBN  978-1-60327-316-9. PMID  19513651.
  8. ^ Zeng, Jieming; Du, Juan; Zhao, Ying; Palanisamy, Nallasivam; Wang, Shu (2007). „Přechodná a stabilní transgenní exprese zprostředkovaná bakulovirovým vektorem v lidských embryonálních kmenových buňkách“. Kmenové buňky. 25 (4): 1055–1061. doi:10.1634 / kmenové články 2006-0616. PMID  17420229.
  9. ^ Cheshenko, N; Krougliak, N; Eisensmith, RC; Krougliak, VA (2001). „Nový systém pro produkci plně odstraněných vektorů adenoviru, který nevyžaduje pomocný adenovirus“. Genová terapie. 8 (11): 846–854. doi:10.1038 / sj.gt.3301459. PMID  11423932.
  10. ^ Ames, Robert; Nuthulaganti, Parvathi; Fornwald, Jim; Shabon, Usman; Van-Der-Keyl, Harjeet; Elshourbagy, Nabil (2004). "Heterologní exprese G proteinu? Spojené receptory v buňkách osteosarkomu U-2 OS". Receptory a kanály. 10 (3–4): 117–124. doi:10.1080/10606820490515012. PMID  15512846.
  11. ^ Cheng, T; Xu, CY; Wang, YB; Chen, M; Wu, T; Zhang, J; Xia, NS (2004). „Rychlá a účinná metoda exprese cílových genů v savčích buňkách bakulovirem“. World Journal of Gastroenterology. 10 (11): 1612–8. doi:10,3748 / wjg.v10.i11.1612. PMC  4572764. PMID  15162535.
  12. ^ Pfohl, JL; Worley Jf, 3. místo; Condreay, JP; An, G; Apolito, CJ; Kost, TA; Truax, JF (2002). "Titrace exprese kanálu KATP v savčích buňkách s využitím rekombinantní bakulovirové transdukce". Receptory a kanály. 8 (2): 99–111. doi:10.1080/10606820212396. PMID  12448791.
  13. ^ Jorio, H .; Tran, R .; Kamen, A. (2006). "Stabilita zásob bez séra a purifikovaných bakulovirových kmenů za různých skladovacích podmínek". Pokrok v biotechnologii. 22 (1): 319–325. doi:10.1021 / bp050218v. PMID  16454526.
  14. ^ Kost, T. A. a Condreay, J. P. 2002a. Aplikovaná biologická bezpečnost 7: 167–169.
  15. ^ Kost, T. A., Condreay, J. P. a Mickelson, C. A. 2000. Bisafety a vektory přenosu virových genů. In Biologická bezpečnost, principy a postupy, 3. vyd. D. O. Fleming a D. L. Hunt (eds.), American Society for Microbiology Press, Washington D.C., str. 579–597.
  16. ^ Smith, GE; Summers, MD; Fraser, MJ (1983). "Produkce lidského beta interferonu v hmyzích buňkách infikovaných bakulovirovým expresním vektorem". Molekulární a buněčná biologie. 3 (12): 2156–65. doi:10.1128 / MCB.3.12.2156. PMC  370086. PMID  6318086.
  17. ^ Matilainen, H .; Rinne, J .; Gilbert, L .; Marjomaki, V .; Reunanen, H .; Oker-Blom, C. (2005). "Vstup bakuloviru do lidských buněk hepatomu". Journal of Virology. 79 (24): 15452–15459. doi:10.1128 / JVI.79.24.15452-15459.2005. PMC  1316037. PMID  16306616.
  18. ^ Long, G .; Pan, X .; Kormelink, R .; Vlak, J. M. (2006). „Funkční vstup bakuloviru do buněk hmyzu a savců závisí na endocytóze zprostředkované klatrinem“. Journal of Virology. 80 (17): 8830–8833. doi:10.1128 / JVI.00880-06. PMC  1563848. PMID  16912330.
  19. ^ Kenoutis, C .; Efrose, R. C .; Swevers, L .; Lavdas, A. A .; Gaitanou, M .; Matsas, R .; Iatrou, K. (2006). „Dodání genu zprostředkovaného bakulovirem do savčích buněk nemění jejich transkripční a diferenciační potenciál, ale je doprovázeno včasnou expresí virového genu“. Journal of Virology. 80 (8): 4135–4146. doi:10.1128 / JVI.80.8.4135-4146.2006. PMC  1440473. PMID  16571829.
  20. ^ Boulaire, Jérôme; Zhao, Ying; Wang, Shu (2009). "Profilování genové exprese k definování reakce hostitele na bakulovirovou transdukci v mozku". Journal of Neurochemistry. 109 (5): 1203–1214. doi:10.1111 / j.1471-4159.2009.06015.x. PMID  19476540.
  21. ^ Jardin, B; Zhao, Y; Selvaraj, M; Montes, J; Tran, R; Prakash, S; Elias, C (2008). "Exprese SEAP (vylučovaná alkalická fosfatáza) baculovirem zprostředkovanou transdukcí buněk HEK 293 v systému bioreaktorů z dutých vláken". Journal of Biotechnology. 135 (3): 272–280. doi:10.1016 / j.jbiotec.2008.04.006. PMID  18499293.
  22. ^ Ames, Robert; Fornwald, James; Nuthulaganti, Parvathi; Trill, John; Foley, James; Buckley, Peter; Kost, Thomas; Wu, Zining; Romanos, Michael (2004). „Rekombinantní bakuloviry BacMam v G proteinu? Objevení navázaného receptorového léčiva“. Receptory a kanály. 10 (3–4): 99–107. doi:10.1080/10606820490514969. PMID  15512844.
  23. ^ Ames, Robert S .; Kost, Thomas A; Condreay, J Patrick (2007). „Technologie BacMam a její aplikace při objevování drog“. Expert Opin Drug Discov. 2 (12): 1669–1681. doi:10.1517/17460441.2.12.1669. PMID  23488908.
  24. ^ Distelmaier, Felix; Koopman, Werner J. H .; Testa, Epifania R .; De Jong, Arjan S .; Swarts, Herman G .; Mayatepek, Ertan; Smeitink, Jan A. M .; Willems, Peter H. G. M. (2008). "Kvantifikace životních buněk potenciálu mitochondriální membrány na úrovni jedné organely". Cytometrie část A. 73A (2): 129–138. doi:10,1002 / cyto.a. 20503. PMID  18163486.
  25. ^ Huwiler, Kristin G .; MacHleidt, Thomas; Chase, Lucas; Hanson, Bonnie; Robers, Matthew B. (2009). "Charakterizace aktivace receptoru serotoninového 5-hydroxytryptaminu-1A pomocí senzoru kinázy 2 regulovaného fosfo-extracelulárním signálem". Analytická biochemie. 393 (1): 95–104. doi:10.1016 / j.ab.2009.06.018. PMID  19539597.
  26. ^ Dukkipati, Abhiram; Park, Hyun Ho; Waghray, Deepak; Fischer, Suzanne; Garcia, Keenan C. (2008). „Systém BacMam pro vysokou úroveň exprese rekombinantních rozpustných a membránových glykoproteinů pro strukturní studie“. Protein Expr Purif. 62 (2): 160–170. doi:10.1016 / j.pep.2008.08.004. PMC  2637115. PMID  18782620.

externí odkazy