Inaktivace virů - Virus inactivation

Virová inaktivace je zastavit viry v daném vzorku z kontaminace požadovaného produktu buď úplným odstraněním virů nebo jejich neinfekcí. Tyto techniky se široce používají v potravinách a krevní plazma[1] průmyslová odvětví, protože tyto produkty mohou být poškozeny přítomností virových částic. Některé z běžnějších virů odstraněných těmito metodami jsou HIV-1 a HIV-2 viry; hepatitida A, B a C; a parvoviry.[2] Tyto metody byly upraveny tak, aby byly odstraněny priony, které nesouvisejí s viry, z krevních produktů.[3]

Odstranění

Tento zastřešující proces, který se stal známým jednoduše jako odstraňování virů, je proces, při kterém jsou všechny viry v daném vzorku odstraněny tradičními metodami extrakce nebo [plnou energií]. Mezi nejvýznamnější metody patří:

Tyto extrakční procesy jsou považovány za „tradiční procesy“, protože žádným způsobem chemicky neovlivňují virus; jednoduše to fyzicky odeberou ze vzorku.

Nanofiltrace

Procesy odstraňování virů pomocí nanofiltračních technik[4] odstranit viry konkrétně vyloučením velikosti. Tento typ procesu se obvykle používá pro parvoviry[5] a další viry obsahující a proteinový obal. Typický virion HIV je 180 nm a typický parvovirus se může pohybovat mezi 15 a 24 nm, což je velmi malé. Jednou z velkých výhod filtrace, na rozdíl od metod zahrnujících extrémní teploty nebo kyselost, je to, že filtrace nebude denaturace bílkoviny ve vzorku. Nanofiltrace je také účinná pro většinu typů proteinů. Protože není chemicky selektivní, bez ohledu na to, jaká je povrchová chemie virové částice, budou procesy odstraňování virů pomocí nanofiltračních technik stále účinné. Další velkou výhodou této techniky je její schopnost být prováděna v laboratorním měřítku a poté efektivně navýšena na výrobní standardy. Je však důležité vzít v úvahu skutečnost, že úroveň odstraňování virů závisí na velikosti pórů nanofiltru. V některých případech nebudou velmi malé viry odfiltrovány. Je také nutné vzít v úvahu možné účinky kolísání tlaku a průtoku.

Některé z filtrů používaných k provádění těchto typů procesů jsou Planova 15N,[6] Planova 20N, BioEX, VAG - 300, Viresolve 180,[7] Viresolve 70TM a Virosart[8] rozsah.

Chromatografie

Chromatografické metody odstraňování virů jsou skvělé pro čištění proteinu a jsou také účinné proti všem typům virů, ale úroveň odstraňování virů závisí na složení kolony a činidlech, která se v procesu používají. Je také třeba poznamenat, že účinnost tohoto procesu se může mezi viry značně lišit a že účinnost procesu se může měnit na základě použité vyrovnávací paměti. Při provádění tohoto postupu je také důležitá hygiena mezi dávkami.

Inaktivace

Inaktivace virů znemožňuje infikování virů. Mnoho virů obsahuje lipid nebo protein nátěry, které lze inaktivovat chemickou změnou. Inaktivace virů se liší od odstraňování virů, protože v dřívějším procesu je povrchová chemie viru pozměněna a v mnoha případech (nyní neinfekční) virové částice zůstávají v konečném produktu. Spíše než jednoduše učinit virus neaktivním, některé procesy inaktivace virů ve skutečnosti denaturace virus úplně. Virová inaktivace je v USA široce používána krevní plazma průmysl.

Aby se dosáhlo deaktivace virů ve vzorku, je nutné provést „speciální“ procesy čištění, které nějakým způsobem viry chemicky pozmění. Mezi nejrozšířenější procesy patří:

  • Inaktivace rozpouštědel / detergentů
  • Pasterizace (topení)
  • Inaktivace kyselého pH

V některých případech není inaktivace viru schůdnou alternativou odstranění, protože i denaturované nebo jinak inaktivované virové částice mohou mít škodlivé účinky na proud procesu nebo na samotný produkt.

Inaktivace rozpouštědla / detergentu (S / D)

Tento proces vyvinutý společností Newyorské krevní centrum,[9] je dosud nejrozšířenější metoda virové inaktivace. Používá se převážně v průmyslu krevní plazmy, více než 50 organizacemi po celém světě a Americký Červený kříž [1]. Tento proces je účinný pouze pro viry zabalené v a lipid kabát, nicméně. Detergenty použité v této metodě přerušují interakce mezi molekulami v lipidovém povlaku viru. Většina obalených virů nemůže existovat bez lipidového povlaku, takže se při působení těchto detergentů zničí. Jiné viry nemusí být zničeny, ale nejsou schopny reprodukovat je neinfekční. Rozpouštědlo vytváří prostředí, ve kterém k agregační reakci mezi lipidovým povlakem a detergentem dochází rychleji. Typicky používaný prací prostředek je Triton X-100.

Chemická struktura Tritonu X-100 (n = 9-10).

Tento proces má mnoho výhod „tradičních“ technik odstraňování. Tento proces nedenaturuje proteiny, protože detergenty ovlivňují pouze lipidy a lipidové deriváty. Tímto procesem je dosaženo 100% virové smrti a zařízení je relativně jednoduché a snadno použitelné. K ochraně proti kontaminaci následných proudů procesu by bylo nutné zařízení určené k čištění post-virového inaktivovaného materiálu.

S / D zpracování využívá snadno dostupná a relativně levná činidla, ale tato činidla musí být z produktu odstraněna před distribucí, což by vyžadovalo další kroky procesu. Protože tento proces odstraňuje / inaktivuje lipidový povlak viru, viry bez jakéhokoli lipidového obalu nebudou ovlivněny. Neexistuje také žádný inaktivační účinek Nárazníky použité v tomto procesu.

Pasterizace

Inaktivace virů pomocí pasterizace může být velmi efektivní, pokud jsou proteiny, které se snažíte chránit, tepelně odolnější než virové nečistoty, se kterými jsou v roztoku. Mezi nejvýznamnější výhody těchto typů procesů patří to, že vyžadují jednoduché vybavení a jsou účinné pro oba obalové procesy a neobalené viry. Protože pasterizace zahrnuje zvýšení teploty roztoku na hodnotu, která bude dostatečně denaturovat virus, nezáleží na tom, zda má virus obálku nebo ne, protože samotná obálka nemůže chránit virus před tak vysokými teplotami. Bylo však zjištěno, že existují některé proteiny, které působí jako tepelné stabilizátory virů. Samozřejmě, pokud cílový protein není odolný vůči teplu, použití této techniky by mohlo denaturovat tento cílový protein i virovou nečistotu. Typická inkubace trvá 10 hodin a provádí se při 60 °C.

Inaktivace kyselého pH

Některé viry, pokud jsou vystaveny nízké pH, bude denaturovat spontánně. Podobně jako při pasterizaci je tato technika pro deaktivaci viru užitečná, pokud je cílový protein odolnější vůči nízkým pH než virová nečistota. Tato technika je účinná proti obaleným virům a typicky používané zařízení je jednoduché a snadno ovladatelné. Tento typ inaktivační metody však není tak účinný pro neobalené viry a vyžaduje také zvýšené teploty. Aby bylo možné použít tuto metodu, musí být cílový protein odolný vůči nízkému pH a vysokým teplotám, což bohužel u mnoha biologických proteinů není. Inkubace pro tento proces typicky probíhá při pH 4 a trvá kdekoli mezi 6 hodinami a 21 dny.

Inaktivace ultrafialovým zářením (UV)

UV záření může poškodit DNA živých organismů vytvořením dimerů nukleových kyselin. Poškození však obvykle nejsou důležitá kvůli nízkému průniku UV záření živými tkáněmi. K deaktivaci virů však lze použít UV paprsky, protože virové částice jsou malé a UV paprsky se mohou dostat ke genetickému materiálu, což indukuje dimerizaci nukleových kyselin. Jakmile je DNA dimerizována, virové částice nemohou replikovat svůj genetický materiál, což jim brání v šíření.

Ukázalo se, že UV světlo v kombinaci s riboflavinem je účinné při snižování patogenů v produktech transfuze krve.[10][11] Riboflavin a UV světlo poškozuje nukleové kyseliny ve virech, bakteriích, parazitech a bílých krvinkách dárců, což znemožňuje jejich replikaci a vyvolání nemoci.[12][13][14]

Spiking studie

V mnoha případech je koncentrace virů v daném vzorku extrémně nízká. V jiných extrakčních procesech může být nízká úroveň nečistot zanedbatelná, ale protože viry ano infekční nečistoty, dokonce i jedna virová částice může stačit ke zničení celého procesního řetězce. Z tohoto důvodu musí být přijata zvláštní opatření k určení vhodné metody odstranění nebo inaktivace pro jakýkoli typ viru extrahovaného z jakéhokoli typu roztoku.

Spiking studie byly vytvořeny speciálně pro tento účel. Špičková studie je studie prováděná za účelem stanovení možných metod odstranění nebo inaktivace virů. Výsledky těchto studií jsou číselné a na základě těchto čísel mohou vědci určit, zda bude proces, na kterém byla studie provedena, vhodný pro viry, které se snaží extrahovat, a pro řešení, ze kterého se je snaží extrahovat .

Metoda

Experimenty prokázaly, že zvýšení počtu virů (nebo úrovně aktivity) vzorku faktorem 104 nebo 105 originálu změní pouze poměry odstranění / inaktivace viru o jeden řád [reference?]. Z těchto znalostí byly vytvořeny studie spiking, ve kterých je počet virů (nebo úroveň aktivace) zvýšen nebo „zvýšen“ o faktor 104 nebo 105 původního vzorku. Tento nový vysoký počet nebo úroveň aktivity se poté provede procesním proudem a vyčistí se. Počet nebo úroveň aktivity se měří na začátku a na konci toku procesu a používá se při výpočtu redukčního faktoru.

Redukční faktor

Redukční faktor (RF) pro krok odstranění nebo deaktivace viru se vypočítá pomocí následující rovnice:[15]

RFkrok = log10 [(V1 x T1) / (V2 x T2)]

Kde: V1 = objem obohacené suroviny před krokem čištění; T1 = koncentrace viru v obohacené surovině před krokem čištění; V2 = objem materiálu po kroku čištění; a T2 = koncentrace viru v materiálu po kroku čištění.

Redukční faktor potřebný pro určitý proud procesu závisí na mnoha různých faktorech, z nichž některé zahrnují:

  • Očekávaná počáteční koncentrace viru
  • Produkt se čistí
  • Infekční dávka viru (pro in vivo používání)
  • Zda je deaktivace životaschopnou alternativou úplného odstranění
  • Schopnosti laboratoře
  • Relativní obtížnost metody deaktivace nebo odstranění

Aplikace

Tato technologie se hojně používá v potravinářském a farmaceutickém průmyslu, ale některé další aplikace zpracování virů byly:

  • Čištění vzduchu (Millipore) [16]
  • Vakcíny
  • Extrakce virových vzorků
  • Čištění vody
  • Inaktivace viru západního Nilu

Reference

  1. ^ Shander A, Lobel GP, Javidroozi M (červen 2016). „Transfuzní postupy a infekční rizika“. Odborný přehled hematologie. 9 (6): 597–605. doi:10.1586/17474086.2016.1164593. PMID  26959944.
  2. ^ Di Minno G, Perno CF, Tiede A, Navarro D, Canaro M, Güertler L, Ironside JW (leden 2016). „Současné koncepce prevence přenosu patogenů při krvácivých poruchách pomocí produktů získaných z krve / plazmy“. Krevní recenze. 30 (1): 35–48. doi:10.1016 / j.blre.2015.07.004. PMC  7115716. PMID  26381318.
  3. ^ Turner ML (2018). „Bezpečnost krve, krevních derivátů a produktů získaných z plazmy“. Příručka klinické neurologie. 153: 463–472. doi:10.1016 / B978-0-444-63945-5.00026-X. PMID  29887153.
  4. ^ „Nanofiltrace“. Eurodia.com. Citováno 2010-11-23.
  5. ^ „Velká obrázková kniha virů - parvoviry“. Virology.net. Citováno 2010-11-23.
  6. ^ "Planova: Home". Asahi-kasei.co.jp. 29. 07. 2010. Citováno 2010-11-23.
  7. ^ "Modul procesní oblasti Viresolve". Millipore. Citováno 2010-11-23.
  8. ^ „Sartorius AG Microsites: Virosart“. microsite.sartorius.com. Citováno 2016-05-24.
  9. ^ „New York Blood Center“. Nybloodcenter.org. Citováno 2010-11-23.
  10. ^ Ruane PH a kol., „Fotochemická inaktivace vybraných virů a bakterií v destičkových koncentrátech pomocí riboflavinu a světla.“ Transfusion 2004; 44: 877-885.
  11. ^ de Cock, et al., „The Mirasol Evaluation Program: Use of Mirasol PRT for trombocy in rutin Clinical Practice>“ Transfusion 2008: 48 (Suppl.): 156A
  12. ^ Goodrich RP, et al., Kapitola 5: „Antivirové a antibakteriální vlastnosti riboflavinu a světla: aplikace pro bezpečnost krve a transfúzní medicínu.“ Flavins: Photochemistry and Photobiology, sv. 6, 2006, Royal Society of Chemistry; Cambridge, Velká Británie. E Silva a AM Edwards, redaktoři.
  13. ^ Kumar V, et al., „Redukce patogenu na základě riboflavinu a UV záření: rozsah a důsledky poškození DNA na molekulární úrovni.“ Fotochemie a fotobiologie 2004; 80: 15-21.
  14. ^ Goodrich, RP a kol., „Definování„ adekvátního “výkonu při snižování patogenu u transfúzních krevních složek.“ Přijato k publikaci Transfusion 2010
  15. ^ Poznámka k pokynům k validačním studiím virů: Návrh, přínos a interpretace studií validujících deaktivaci a odstranění virů, EMEA CPMP BWP, 268/95 1996
  16. ^ „Optimalizace výkonu virových filtrů pomocí předfiltrování“. Millipore. Citováno 2010-11-23.