Sekvenování transposonu - Transposon sequencing

Sekvenování inzerce transposonu (Tn-seq) kombinuje transpozonová inzerční mutageneze s masivně paralelní řazení (MPS) míst inzerce transpozonu k identifikaci genů přispívajících k zájmové funkci bakterie. Metoda byla původně založena souběžnou prací ve čtyřech laboratořích pod zkratkami HITS[1], INSeq[2], TraDIS[3]a Tn-Seq[4]. Četné variace byly následně vyvinuty a aplikovány na různé biologické systémy. Souhrnně jsou metody často označovány jako Tn-Seq, protože všechny zahrnují sledování vhodnosti mutantů inzerujících transpozon pomocí přístupů sekvenování DNA [5].

Transpozony jsou vysoce regulované, diskrétní DNA segmenty, které se mohou přemístit v genomu. Jsou univerzální a nacházejí se v Eubakterie, Archaea, a Eukarya, včetně lidí. Transpozony mají velký vliv na genová exprese a lze je použít ke stanovení genové funkce. Ve skutečnosti, když se transposon vloží do genu, bude funkce genu narušena.[6] Kvůli této vlastnosti byly transpozony manipulovány pro použití při inzerční mutagenezi.[7] Vývoj sekvenování mikrobiálních genomů byl hlavním pokrokem v použití transposonové mutageneze.[8][9] Funkce ovlivněná inzercí transpozonu by mohla být spojena s narušeným genem sekvenováním genomu za účelem lokalizace místa inzerce transpozonu. Masivně paralelní sekvenování umožňuje simultánní sekvenování míst inzerce transpozonu ve velkých směsích různých mutantů. Proto je proveditelná analýza v celém genomu, pokud jsou transpozony umístěny v celém genomu ve sbírce mutantů.[5]

Sekvenování transposonů vyžaduje vytvoření knihovny pro transpozonovou inzerci, která bude obsahovat skupinu mutantů, které mají společně transpozonové inzerce ve všech nepodstatných genech. Knihovna je pěstována za experimentálních podmínek zájmu. Mutanti s transpozony vloženými do genů potřebných pro růst za testovacích podmínek budou z populace klesat ve frekvenci. K identifikaci ztracených mutantů jsou genomové sekvence sousedící s konci transpozonu amplifikovány pomocí PCR a sekvenovány pomocí MPS k určení umístění a četnosti každé inzerční mutace. Důležitost každého genu pro růst za testovacích podmínek se stanoví porovnáním množství každého mutanta před a po růstu za zkoumaných podmínek. Tn-seq je užitečný jak pro studium fitness jediného genu, tak pro genové interakce [10]

Signature-tagged mutagenesis (STM) je starší technika, která také zahrnuje sdružování mutantů inzerce transpozonu, aby se určila důležitost narušených genů za podmínek selektivního růstu.[11] Vysoce výkonné verze STM používají genomické mikropole, které jsou méně přesné a mají nižší dynamický rozsah než masivně paralelní řazení.[5] S vynálezem sekvenování nové generace se genomová data stávala stále dostupnějšími. Navzdory nárůstu genomových údajů však naše znalost funkce genů zůstává limitujícím faktorem v našem chápání role genů.[12][13] Proto byla nutná potřeba vysoce výkonného přístupu ke studiu vztahů genotyp-fenotyp, jako je Tn-seq.

Metodologie

Vkládání transposonů metodou Tn-seq.

Transposonové sekvenování začíná transdukcí bakteriálních populací pomocí transponovatelných prvků bakteriofágy. Tn-seq používá transpozon Himar I Mariner, běžný a stabilní transposon. Po transdukci se DNA štěpí a vložená sekvence se amplifikuje PCR. Rozpoznávací místa pro MmeI, restrikční endonukleázu typu IIS, lze zavést jedinou změnou nukleotidů v terminálních opakováních Marinera.[14] Nachází se 4 bp před koncem opakování terminálu. MmeI vytvoří 2 bp střídavě rozřezané 20 bází po proudu od rozpoznávacího místa.[15] Když MmeI štěpí DNA z knihovny mutantů inzerujících transpozon, vytvoří se fragmentovaná DNA včetně levého a pravého transposonu a 16 bp okolní genomové DNA. Fragment 16 bp stačí k určení polohy inzerce transposonu v bakteriálním genomu. Ligaci adaptéru usnadňuje 2 převis základny. Primer specifický pro adaptér a primer specifický pro transposon se používají k amplifikaci sekvence pomocí PCR. 120bp produkt se poté izoluje za použití agarózového gelu nebo PAGE čištění. Masivně paralelní sekvenování se poté použije ke stanovení sekvencí lemujících 16 bp.[10] Genová funkce je odvozena po pohledu na účinky inzerce na genovou funkci za určitých podmínek.

Výhody a nevýhody

Na rozdíl od vysokorychlostního vkládání stopy pomocí hlubokého sekvenování (HITS) a sekvenování místa vložení zaměřeného na transposon (TraDIS) je Tn-seq specifický pro Transpozice Himar I Mariner, a nelze je použít na jiné transpozony nebo vkládací prvky.[10] Protokol pro Tn-seq je však časově méně náročný. HITS a TraDIS používají techniku ​​stříhání DNA, která produkuje řadu PCR velikosti produktů, které by mohly způsobit, že se kratší šablony DNA přednostně zesilují nad delšími šablonami. Tn-seq produkuje produkt, který má jednotnou velikost, čímž se snižuje možnost zkreslení PCR.[10]

Tn-seq lze použít k identifikaci jak zdatnosti jednotlivých genů, tak k mapování genových interakcí v mikroorganismech. Stávající metody pro tyto typy studií jsou závislé na již existujících genomových mikročipech nebo genových knockoutových polích, zatímco Tn-seq není. Využití Tn-seq masivně paralelní řazení dělá tuto techniku ​​snadno reprodukovatelnou, citlivou a robustní.[10]

Aplikace

Tn-seq se ukázal být užitečnou technikou pro identifikaci nových genových funkcí. Vysoce citlivá povaha Tn-seq může být použita k určení vztahů fenotyp-genotyp, které mohly být méně citlivými metodami považovány za nevýznamné. Tn-seq identifikoval esenciální geny a cesty, které jsou důležité pro využití cholesterolu v Mycobacterium tuberculosis.[16]

Tn-seq se používá ke studiu organizace genomu vyššího řádu pomocí genových interakcí. Geny fungují jako vysoce propojená síť; aby bylo možné studovat vliv genu na fenotyp, je také třeba vzít v úvahu genové interakce. Tyto genové sítě lze studovat skríninkem syntetické letality a genových interakcí, kde dvojitý mutant vykazuje neočekávanou hodnotu vhodnosti ve srovnání s každým jednotlivým mutantem. Tn-seq byl použit ke stanovení genetických interakcí mezi pěti dotazovanými geny a zbytkem genomu u Streptococcus pneumoniae, které odhalily jak přitěžující, tak zmírňující genetické interakce.[17] Bylo zjištěno, že jeden ze studovaných genů (ccpA) interaguje s 64 dalšími geny a je považován za hlavní regulační komplex metabolismu uhlohydrátů v Streptococcus pneumoniae.[10]

Tn-seq použitý v kombinaci s RNA-seq lze použít k prozkoumání role nekódujících oblastí DNA. Tato metoda identifikovala 56 nových sRNA v nekódujících oblastech S. pneumoniae.[18]

Reference

  1. ^ Gawronski JD, Wong SM, Giannoukos G, Ward DV, Akerley BJ. Sledování inzerčních mutantů v knihovnách pomocí hlubokého sekvenování a celogenomového screeningu genů Haemophilus požadovaných v plicích. Proc Natl Acad Sci USA. 2009; 106: 16422–7. doi: 10,1073 / pnas.0906627106.Článek zdarma PMC
  2. ^ Goodman AL, McNulty NP, Zhao Y, Leip D, Mitra RD, Lozupone CA a kol. Identifikace genetických determinantů potřebných k založení lidského střevního symbionta v jeho prostředí. Buněčný hostitelský mikrob. 2009; 6: 279–89. doi: 10.1016 / j.chom.2009.08.003.
  3. ^ Langridge GC, Phan MD, Turner DJ, Perkins TT, Parts L, Haase J a kol. Simultánní analýza každého genu Salmonella Typhi s použitím jednoho milionu transposonových mutantů. Genome Res. 2009; 19: 2308–16. doi: 10,1101 / gr.097097.109.
  4. ^ van Opijnen T, Bodi KL, Camilli A. Tn-seq: vysoce výkonné paralelní sekvenování pro fitness a genetické interakční studie v mikroorganismech. Nat metody. 2009; 6: 767–72. doi: 10,1038 / nmeth.1377.
  5. ^ A b C Barquist L, Boinett CJ, Cain AK (červenec 2013). „Přístupy k dotazování bakteriálních genomů pomocí sekvenování inzerce transpozonu“. RNA Biology. 10 (7): 1161–9. doi:10,4161 / rna.24765. PMC  3849164. PMID  23635712.
  6. ^ Hayes F (2003). „Strategie založené na transposonu pro mikrobiální funkční genomiku a proteomiku“. Výroční přehled genetiky. 37 (1): 3–29. doi:10.1146 / annurev.genet.37.110801.142807. PMID  14616054.
  7. ^ Kleckner N, Chan RK, Tye BK, Botstein D (říjen 1975). "Mutageneze vložením prvku rezistence na léčivo nesoucího obrácené opakování". Journal of Molecular Biology. 97 (4): 561–75. doi:10.1016 / s0022-2836 (75) 80059-3. PMID  1102715.
  8. ^ Smith V, Chou KN, Lashkari D, Botstein D, Brown PO (prosinec 1996). „Funkční analýza genů kvasinkového chromozomu V genetickou stopou“. Věda. 274 (5295): 2069–74. Bibcode:1996Sci ... 274.2069S. doi:10.1126 / science.274.5295.2069. PMID  8953036.
  9. ^ Akerley BJ, Rubin EJ, Camilli A, Lampe DJ, Robertson HM, Mekalanos JJ (červenec 1998). „Systematická identifikace základních genů in vitro námořní mutagenezí“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 95 (15): 8927–32. Bibcode:1998PNAS ... 95.8927A. doi:10.1073 / pnas.95.15.8927. PMC  21179. PMID  9671781.
  10. ^ A b C d E F van Opijnen T, Bodi KL, Camilli A (říjen 2009). „Tn-seq: vysoce výkonné paralelní sekvenování pro studium kondice a genetické interakce v mikroorganismech“. Přírodní metody. 6 (10): 767–72. doi:10.1038 / nmeth.1377. PMC  2957483. PMID  19767758.
  11. ^ Mazurkiewicz P, Tang CM, Boone C, Holden DW (prosinec 2006). „Signature-tagged mutagenesis: barcoding mutants for genome-wide screens“. Genetika hodnocení přírody. 7 (12): 929–39. doi:10.1038 / nrg1984. PMID  17139324.
  12. ^ Bork P (duben 2000). „Pravomoci a úskalí v sekvenční analýze: 70% překážka“. Výzkum genomu. 10 (4): 398–400. doi:10,1101 / gr. 10.4.398. PMID  10779480.
  13. ^ Kasif S, Steffen M (leden 2010). „Biochemické sítě: vývoj anotace genů“. Přírodní chemická biologie. 6 (1): 4–5. doi:10.1038 / nchembio.288. PMC  2907659. PMID  20016491.
  14. ^ Goodman AL, McNulty NP, Zhao Y, Leip D, Mitra RD, Lozupone CA, Knight R, Gordon JI (září 2009). „Identifikace genetických determinantů potřebných k ustavení lidského střevního symbiontu v jeho prostředí“. Mobilní hostitel a mikrob. 6 (3): 279–89. doi:10.1016 / j.chom.2009.08.003. PMC  2895552. PMID  19748469.
  15. ^ Morgan RD, Dwinell EA, Bhatia TK, Lang EM, Luyten YA (srpen 2009). „Rodina MmeI: enzymy restrikční modifikace typu II, které používají pro ochranu hostitele jednovláknovou modifikaci. Výzkum nukleových kyselin. 37 (15): 5208–21. doi:10.1093 / nar / gkp534. PMC  2731913. PMID  19578066.
  16. ^ Griffin JE, Gawronski JD, Dejesus MA, Ioerger TR, Akerley BJ, Sassetti CM (září 2011). „Fenotypové profilování s vysokým rozlišením definuje geny nezbytné pro růst mykobakterií a katabolismus cholesterolu“. PLOS patogeny. 7 (9): e1002251. doi:10.1371 / journal.ppat.1002251. PMC  3182942. PMID  21980284.
  17. ^ van Opijnen T, Bodi KL, Camilli A. Tn-seq: vysoce výkonné paralelní sekvenování pro fitness a genetické interakční studie v mikroorganismech. Nat metody. 2009; 6: 767–72. doi: 10,1038 / nmeth.1377.
  18. ^ Mann B, van Opijnen T, Wang J, Obert C, Wang YD, Carter R, McGoldrick DJ, Ridout G, Camilli A, Tuomanen EI, Rosch JW (2012). "Kontrola virulence malými RNA v Streptococcus pneumoniae". PLOS patogeny. 8 (7): e1002788. doi:10.1371 / journal.ppat.1002788. PMC  3395615. PMID  22807675.