SnRNA-seq - SnRNA-seq

snRNA-seq, také známý jako sekvenování jednoho jádra RNA, jednojádrové sekvenování RNA nebo sNuc-seq, je Sekvenování RNA metoda profilování genová exprese v buňky které je obtížné izolovat, například tkáně z archivovaných tkání nebo je obtížné je oddělit. Je to alternativa k jednobuněčný RNA seq (scRNA-seq), jak analyzuje jádra místo neporušených buněk.

snRNA-seq minimalizuje výskyt falešné genové exprese, protože lokalizace plně zralého ribozomy do cytoplazma znamená, že jakýkoli mRNA z transkripční faktory které jsou vyjádřeny poté, co nelze disociační proces přeložit, a tedy nelze přepsat jejich následné cíle.[1]. Technologie snRNA-seq navíc umožňuje objev nových typů buněk, které by jinak bylo obtížné izolovat.

Metody a technologie

Základní metoda snRNA-seq vyžaduje 4 hlavní kroky: zpracování tkáně, izolace jader, třídění buněk a sekvenování. Aby bylo možné izolovat a sekvenovat RNA uvnitř jádra, snRNA-seq zahrnuje použití rychlého a mírného jaderného disociačního protokolu. Tento protokol umožňuje minimalizovat technické problémy, které mohou ovlivnit studie, zejména ty, kterých se týká okamžitý časný gen (IEG) chování.

Výsledné disociované buňky jsou suspendovány a suspenze jemně lyžována, což umožňuje oddělení buněčných jader od jejich cytoplazmatických lyzátů pomocí centrifugace[2]. Tato oddělená jádra / buňky jsou tříděna pomocí FACS do jednotlivých jamek a amplifikována pomocí mikrofluidického aparátu[2]. Sekvenování probíhá jako obvykle a data mohou být analyzována jako vhodná pro jeho použití. Tato základní metodologie snRNA-seq je schopna profilovat RNA z tkání, které jsou konzervované nebo nemohou být disociovány, ale nemá vysokou propustnost díky své závislosti na třídění jader pomocí FACS[3]. Tuto techniku ​​nelze snadno škálovat na profilování velkého počtu jader nebo vzorků. Masivně paralelní metody scRNA-seq existují a lze je snadno škálovat, ale jejich požadavek na suspenzi jedné buňky jako vstupu není ideální a eliminuje část flexibility, která je k dispozici s metodou snRNA-seq, pokud jde o typy tkání a buněk, které lze zkoumat[3]. V reakci na to vědci z Broad Institute of MIT a Harvard vyvinuli metodu DroNc-Seq masivně paralelního snRNA-seq s kapičkovou technologií[3]. V této technice jsou jádra, která byla izolována z jejich fixované nebo zmrazené tkáně, zapouzdřena v kapičkách s jedinečně čárovými kuličkami, které jsou potaženy oligonukleotidy obsahujícími 30-koncový úsek deoxythyminu (dT)[4]. Tento povlak zachycuje obsah polyadenylované mRNA produkovaný při lýze jader uvnitř kapiček[4]. Zachycená mRNA je po rozbití emulze reverzně transkribována do cDNA[4]. Sekvenování této cDNA produkuje transkriptomy všech sledovaných jednotlivých jader a tyto lze použít k mnoha účelům, včetně identifikace jedinečných typů buněk[5].

Sekvenční nástroje a vybavení používané v scRNA-seq lze použít s modifikacemi pro snRNA-seq experimenty. Illumina nastiňuje pracovní postup pro základní metodu snRNA-seq, kterou lze provádět se stávajícím zařízením[2]. DroNc-Seq lze dosáhnout pomocí mikrofluidních platforem, které jsou určeny pro metodu scRNA-seq Drop-seq. Dolomite Bio však přizpůsobil jeden ze svých nástrojů, automatizovanou platformu Nadia pro scRNA-seq, aby se nativně používala také pro DroNc-Seq[5]. Tento nástroj by mohl zjednodušit generování knihoven sekvenování jednotlivých jader, protože se používá pro zamýšlený účel.

Pokud jde o analýzu dat po sekvenování, laboratoř McCarroll na Harvardu vyvinula výpočetní kanál známý jako dropSeqPipe[6]. Přestože byl kanál původně vyvinut pro použití s ​​daty Drop-seq scRNA-seq, lze jej použít s daty DroNc-Seq, protože také využívá technologii kapiček.

Rozdíl mezi snRNA-seq a scRNA-seq

snRNA-seq používá izolovaná jádra namísto celých buněk k profilování genové exprese. To znamená, že scRNA-seq měří jak cytoplazmatické, tak jaderné přepisy, zatímco snRNA-seq měří hlavně jaderné přepisy (i když některé přepisy mohou být připojeny k hrubému endoplazmatickému retikulu a částečně zachovány v jaderných prepsech)[7]. To umožňuje, aby snRNA-seq postupovala pouze v jádře a ne v celé buňce. Z tohoto důvodu je snRNA-Seq ve srovnání se scRNA-seq vhodnější pro profilování genové exprese v buňkách, které se obtížně izolují (např. Adipocyty, neurony), a také v konzervovaných tkáních[5].

Navíc jádra potřebná pro snRNA-seq lze rychle a snadno získat z čerstvých, lehce fixovaných nebo zmrazených tkání, zatímco izolace jednotlivých buněk pro jednobuněčné RNA-seq (scRNA-seq) zahrnuje prodlouženou inkubaci a zpracování. To dává vědcům možnost získat transkriptomy, které nejsou tak rušené během izolace.

aplikace

V neurovědě mají neurony vzájemně propojenou povahu, což ztěžuje izolaci neporušených jednotlivých neuronů[8]. Jelikož se snRNA-seq ukázala jako alternativní metoda hodnocení transkriptomu buňky izolací jednotlivých jader, bylo možné provádět posmrtné lidské mozkové tkáně studie jednotlivých neuronů[9]. snRNA-seq také umožnil první samostatnou neuronovou analýzu okamžité rané genové exprese (IEG) spojené s tvorbou paměti v myším hipokampu[1]. V roce 2019 použili Dmitry a kol. Metodu na kortikální tkáni pacientů s ASD k identifikaci transkriptomických změn souvisejících s ASD ve specifických typech buněk, což je první hodnocení transkriptomu specifické pro daný typ mozku v mozku postiženém ASD[10].

Mimo neurovědy se snRNA-seq používá také v jiných oblastech výzkumu. V roce 2019 Haojia et al srovnávali scRNA-seq a snRNA-seq v genomické studii kolem ledvin. Zjistili, že snRNA-seq dosahuje ekvivalentní rychlosti detekce genů jako scRNA-seq u dospělých ledvin s několika významnými výhodami (včetně kompatibility se zmrazenými vzorky, sníženého zkreslení disociace atd.)[11]. V roce 2019 Joshi et al použili snRNA-seq ve studii biologie lidských plic, ve které zjistili, že snRNA-seq umožňuje nestrannou identifikaci typů buněk ze zmrazených zdravých a fibrotických plicních tkání[12]. U dospělých savčích srdečních tkání může být extrémně těžké disociovat bez poškození buněk, což neumožňuje snadné sekvenování tkáně. V roce 2020 však němečtí vědci představili první zprávu o sekvenování dospělého savčího srdce pomocí snRNA-seq a byli schopni zajistit praktické distribuce buněčného typu v srdci[13]

Výhody a nevýhody snRNA-seq

Profesionálové

  1. Ve scRNA-seq může disociační proces narušit některé citlivé buňky a některé buňky v určitých tkáních (např. Kolagenní matrice[11]) může být velmi těžké oddělit. Takovým problémům lze zabránit v sekvenci snRNA, protože stačí izolovat jediné jádro namísto celé jednotlivé buňky.
  2. Na rozdíl od scRNA-seq má snRNA-seq rychlé a mírné protokoly disociace jader, které by předešly technickým problémům vznikajícím při zahřívání, trávení proteázou a klamné genové expresi způsobené cytoplazmatickými ribozomy.[2]
  3. snRNA-seq funguje velmi dobře pro konzervované / zmrazené tkáně.[5]

Nevýhody

  1. Sekvenování RNA v cytoplazmě (genové izoformy, RNA v mitochondriích a chloroplastech atd.) Není možné, protože snRNA-seq většinou měří nukleární transkripty.

Reference

  1. ^ A b Lacar, Benjamin; Linker, Sara B .; Jaeger, Baptiste N .; Krishnaswami, Suguna; Barron, Jerika; Kelder, Martijn; Parylak, Sarah; Paquola, Apuã; Venepally, Pratap; Novotný, Mark; O'Connor, Carolyn (2016-04-19). „Nukleární sekvence RNA jednotlivých neuronů odhaluje molekulární podpisy aktivace“. Příroda komunikace. 7: 11022. Bibcode:2016NatCo ... 711022L. doi:10.1038 / ncomms11022. ISSN  2041-1723. PMC  4838832. PMID  27090946.
  2. ^ A b C d "snRNA-Seq". www.illumina.com. Citováno 2020-02-28.
  3. ^ A b C Habib, Naomi; Avraham-Davidi, Inbal; Basu, Anindita; Burks, Tyler; Shekhar, Karthik; Hofree, Matan; Choudhury, Sourav R .; Aguet, François; Gelfand, Ellen; Ardlie, Kristin; Weitz, David A. (říjen 2017). "Masivně paralelní jednojádrový RNA-seq s DroNc-seq". Přírodní metody. 14 (10): 955–958. doi:10.1038 / nmeth.4407. ISSN  1548-7105. PMC  5623139. PMID  28846088.
  4. ^ A b C F, J (7. listopadu 2018). „Vysoce výkonná analýza transkriptomů jednotlivých jader pomocí nástroje Nadia společnosti Dolomite Bio“ (PDF). Dolomit Bio. Citováno 27. února 2020.
  5. ^ A b C d Bio, Dolomit. "Single Nuclei RNA-Seq (sNuc-Seq)". Dolomit Bio. Citováno 2020-02-27.
  6. ^ Macosko, Evan Z .; Basu, Anindita; Satija, Rahul; Nemesh, James; Shekhar, Karthik; Goldman, Melissa; Tirosh, Itay; Bialas, Allison R .; Kamitaki, Nolan; Martersteck, Emily M .; Trombetta, John J. (2015-05-21). „Vysoce paralelní profilování exprese jednotlivých buněk v celém genomu pomocí kapiček Nanoliter“. Buňka. 161 (5): 1202–1214. doi:10.1016 / j.cell.2015.05.002. ISSN  0092-8674. PMC  4481139. PMID  26000488.
  7. ^ Bakken, Trygve E .; Hodge, Rebecca D .; Miller, Jeremy A .; Yao, Zizhen; Nguyen, Thuc Nghi; Aevermann, Brian; Barkan, Eliza; Bertagnolli, Darren; Casper, Tamara; Dee, Nick; Garren, Emma (26. 12. 2018). „Transkriptomy s jedním jádrem a jednou buňkou ve srovnání s odpovídajícími typy kortikálních buněk“. PLOS ONE. 13 (12): e0209648. Bibcode:2018PLoSO..1309648B. doi:10.1371 / journal.pone.0209648. ISSN  1932-6203. PMC  6306246. PMID  30586455.
  8. ^ Lake, Blue B .; Codeluppi, Simone; Yung, Yun C .; Gao, Derek; Chun, Jerold; Kharchenko, Peter V .; Linnarsson, Sten; Zhang, Kun (2017-07-20). „Srovnávací strategie pro transkriptomy s jedním jádrem a jednou buňkou potvrzuje přesnost v predikované expresi buněčného typu z jaderné RNA“. Vědecké zprávy. 7 (1): 6031. Bibcode:2017NatSR ... 7.6031L. doi:10.1038 / s41598-017-04426-w. ISSN  2045-2322. PMC  5519641. PMID  28729663.
  9. ^ Krishnaswami, Suguna Rani; Grindberg, Rashel V .; Novotný, Mark; Venepally, Pratap; Lacar, Benjamin; Bhutani, Kunal; Linker, Sara B .; Pham, Son; Erwin, Jennifer A .; Miller, Jeremy A .; Hodge, Rebecca (březen 2016). „Použití jednotlivých jader pro RNA-seq k zachycení transkriptomu posmrtných neuronů“. Přírodní protokoly. 11 (3): 499–524. doi:10.1038 / nprot.2016.015. ISSN  1750-2799. PMC  4941947. PMID  26890679.
  10. ^ Velmeshev, Dmitrij; Schirmer, Lucas; Jung, Diane; Haeussler, Maximilian; Perez, Yonatan; Mayer, Simone; Bhaduri, Aparna; Goyal, Nitasha; Rowitch, David H .; Kriegstein, Arnold R. (2019-05-17). „Jednobuněčná genomika identifikuje molekulární změny specifické pro buněčný typ autismu. Věda. 364 (6441): 685–689. doi:10.1126 / science.aav8130. ISSN  0036-8075. PMID  31097668. S2CID  156055368.
  11. ^ A b Wu, Haojia; Kirita, Yuhei; Donnelly, Erinn L .; Humphreys, Benjamin D. (leden 2019). „Výhody jednoho jádra oproti jednobuněčnému sekvenování RNA u dospělých ledvin: Vzácné typy buněk a nové buněčné stavy odhalené při fibróze“. Časopis Americké nefrologické společnosti. 30 (1): 23–32. doi:10.1681 / ASN.2018090912. ISSN  1046-6673. PMC  6317600. PMID  30510133.
  12. ^ Joshi, N .; Watanabe, S .; Reyfman, P.a .; Bharat, A .; Budinger, G. s .; Misharin, A. (2019-05-01), „Single Nuclei RNA-Seq pro nestranný výčet typů buněk v archivních zmrazených lidských plicních tkáních“, D29. Plíce MULTI-OMICS MECHANISMU, American Conference Thoracic Society International Conference Abstracts, American Thoracic Society, pp. A6077, doi:10.1164 / ajrccm-conference.2019.199.1_meetingabstracts.a6077
  13. ^ Wolfien, Markus; Galow, Anne-Marie; Müller, Paula; Bartsch, Madeleine; Brunner, Ronald M .; Goldammer, Tom; Wolkenhauer, Olaf; Hoeflich, Andreas; David, Robert (únor 2020). „Jednonukleové sekvenování celého savčího srdce: složení a rychlost buněčného typu“. Buňky. 9 (2): 318. doi:10,3390 / buňky9020318. PMC  7072447. PMID  32013057.