Inhibitory polymerázové řetězové reakce - Polymerase chain reaction inhibitors

Inhibitory PCR jsou jakýkoli faktor, který brání zesílení nukleové kyseliny skrz polymerázová řetězová reakce (PCR).[1] Inhibice PCR je nejčastější příčinou selhání amplifikace, pokud jsou přítomny dostatečné kopie DNA.[2] Inhibitory PCR obvykle ovlivňují PCR interakcí s DNA nebo interferencí s DNA polymeráza. Inhibitory mohou uniknout odstranění během postupu čištění DNA vazbou přímo na jednořetězcovou nebo dvouřetězcovou DNA.[3] Případně snížením dostupnosti kofaktory (například Mg2+) nebo jinak interferují s jejich interakcí s DNA polymerázou, je inhibována PCR.[3]

V multiplexní PCR Je možné, že různé sekvence trpí různými inhibičními účinky v různém rozsahu, což vede k rozdílům v jejich relativních amplifikacích.[3]

Druhy inhibitorů

Inhibitory mohou být přítomny v původním vzorku, jako je krev, tkáně, tkáně a půda, ale mohou být také přidány jako výsledek použitých technik zpracování vzorku a extrakce DNA.[3] Přebytečné soli včetně KCl a NaCl, iontové detergenty jako deocycholát sodný, sarkosyl a BL ethanol, isopropanol a fenol mimo jiné přispívají prostřednictvím různých inhibičních mechanismů ke snížení účinnosti PCR.[3]

Vyčíslení rozsahu inhibice

Abychom se pokusili posoudit rozsah inhibice, ke které dochází v reakci, lze provést kontrolu přidáním známého množství templátu k vyšetřované reakční směsi (na základě analyzovaného vzorku). Porovnáním amplifikace tohoto templátu ve směsi s amplifikací pozorovanou v samostatném experimentu, ve kterém je stejný templát použit v nepřítomnosti inhibitorů, lze odvodit rozsah inhibice ve zkoumané reakční směsi.[4][3] Samozřejmě, pokud je jakákoli část inhibice vyskytující se v reakční směsi odvozené od vzorku specifická pro sekvenci, pak tato metoda poskytne podhodnocení inhibice, jak se vztahuje na vyšetřovanou sekvenci (sekvence).

Zabránění inhibici PCR

Kolekce vzorků

Způsob získávání vzorků lze vylepšit, aby se zabránilo zbytečnému shromažďování inhibitorů. Například ve forenzní oblasti může přenos tamponu krve na tkanině nebo slinách na potravinách zabránit nebo snížit kontaminaci inhibitory přítomnými ve tkanině nebo potravině.[3]

Čištění DNA

Existují techniky a komerčně dostupné soupravy, které umožňují extrakci DNA s vyloučením některých inhibitorů.[3]

Složky PCR reakce

Kromě metod odstraňování inhibitorů ze vzorků před PCR nabízejí některé DNA polymerázy různou rezistenci vůči různým inhibitorům a zvyšování koncentrace vybrané DNA polymerázy také poskytuje určitou rezistenci vůči inhibitorům zaměřeným na polymerázu.[3]

Pro PCR na základě vzorků krve se přidá hovězí sérový albumin snižuje účinek některých inhibitorů na PCR.[3]

Viz také

Reference

  1. ^ Wilson, Ian (říjen 1997). „Inhibice a usnadnění amplifikace nukleové kyseliny“. Aplikovaná a environmentální mikrobiologie. 63 (10): 3741–3751. PMC  168683. PMID  9327537.
  2. ^ Alaeddini, Reza (2012). „Forenzní důsledky inhibice PCR - přehled“. Forensic Science International: Genetics. 6 (3): 297–305. doi:10.1016 / j.fsigen.2011.08.006.
  3. ^ A b C d E F G h i j „Úvod do inhibitorů PCR (Promega Corporation)“ (PDF). Citováno 2007-12-15.
  4. ^ Gieffers J, Reusche E, Solbach W, Maass M (2000). „Nedetekování Chlamydia pneumoniae v mozkových částech pacientů s Alzheimerovou chorobou“. J. Clin. Microbiol. 38 (2): 881–2. PMC  86233. PMID  10655406.