Číslo kopie plazmidu - Plasmid copy number

v buněčná biologie, číslo kopie plazmidu je počet kopií daného plazmid v cele. Aby zajistili přežití a tím pokračující šíření plazmidu, musí regulovat počet svých kopií. Pokud má plazmid příliš vysoký počet kopií, může nadměrně zatěžovat svého hostitele tím, že obsadí příliš mnoho buněčných strojů a použije příliš mnoho energie. Na druhou stranu příliš nízký počet kopií může vést k tomu, že plazmid nebude přítomen ve všech potomcích svého hostitele. Plazmidy mohou být buď plazmidy s vysokým počtem kopií, nebo plazmidy s nízkým počtem kopií; regulační mechanismy mezi těmito dvěma typy se často výrazně liší. Biotechnologie aplikace mohou zahrnovat inženýrské plazmidy umožňující velmi vysoký počet kopií. Například, pBR322 je plazmid s nízkým počtem kopií (~ 20 kopií / buňka), ze kterého je několik velmi vysokých kopií klonovací vektory (~ 1000 kopií / buňka) bylo odvozeno.[1]

Nařízení

Plazmidy s vysokým počtem kopií, nazývané také uvolněné plazmidy, vyžadují systém, který zajistí, že replikace bude inhibována, jakmile počet plazmidů v buňce dosáhne určité prahové hodnoty. Uvolněné plazmidy jsou obecně regulovány jedním ze dvou mechanismů: antisense RNA nebo iteron vazebné skupiny. Plazmidy s nízkým počtem kopií, nazývané také přísné plazmidy, vyžadují přísnější kontrolu replikace.

Plazmidy odvozené od ColE1: Antisense RNA

v ColE1 Odvozené plazmidy jsou replikace primárně regulovány pomocí malé plazmidem kódované RNA RNA I. Jediný promotor iniciuje replikaci v ColE1: promotoru RNA II. RNA II přepis tvoří stabilní hybrid RNA-DNA s řetězcem DNA templátu poblíž počátku replikace, kde je poté zpracován RNaseH vyrábět 3 'OH primer že DNA polymeráza I používá k zahájení vedoucí syntéza DNA vlákna. RNA I. slouží jako hlavní inhibitor tohoto procesu kódovaný plazmidem, jehož koncentrace je úměrná počtu kopií plazmidu. RNA I je přesně komplementární s 5 'koncem RNA II (protože je transkribována z opačného řetězce stejné oblasti DNA jako RNA II). RNA I a RNA II nejprve tvoří slabou interakci, která se nazývá polibkový komplex. Líbající komplex je stabilizován tzv. Proteinem Rop (represor primeru) a je vytvořen dvouvláknový RNA duplex RNA-I / RNA-II. Tento pozměněný tvar brání RNA II v hybridizaci s DNA a zpracování z RNaseH za vzniku primeru nezbytného pro zahájení replikace plazmidu. Více RNA I je produkováno, když je koncentrace plazmidu vysoká, a vysoká koncentrace RNA I inhibuje replikaci, což vede k regulaci počtu kopií.[2][3]

Plazmidy R1 a ColIb-p9: Antisense RNA

Většina plazmidů vyžaduje k oddělení řetězců DNA v plazmidu kódovaný protein, obvykle nazývaný Rep původ replikace (oriV) k zahájení replikace DNA. Rep se váže na specifické sekvence DNA v oriV které jsou jedinečné pro typ plazmidu. Syntéza proteinu Rep je řízena, aby se omezila replikace plazmidu a tím se reguloval počet kopií R1 plazmidy RepA lze přepsat ze dvou různých promotorů. Vyrábí se z prvního promotoru, dokud plazmid nedosáhne svého počtu kopií, na kterém je protein CopB potlačuje tohoto primárního promotora.[3] Regulován je také výraz RepA post-transkripčně ze sekundárního promotoru tzv. antisense RNA CopA. CopA interaguje se svým cílem RNA v RepA mRNA a tvoří líbající komplex a poté duplex RNA-RNA. Výsledná dvouvláknová RNA je štěpena RNáza III, zabraňující syntéze RepA. Čím vyšší je koncentrace plazmidu, tím více se produkuje CopA RNA a tím méně syntetizuje se protein RepA, což zvyšuje inhibici replikace plazmidu.[4]

Col1b-P9: Antisense RNA

Replikace nízkého počtu kopií ColIb-P9 závisí na Rep, který je produkován expresí repZ gen. repZ výraz vyžaduje vytvoření a pseudoknot v mRNA. repZ je potlačen malou antisense Inc RNA, na kterou se váže repZ mRNA, tvoří Inc RNA-mRNA duplex a brání tvorbě pseudoknotu, aby se inhiboval repZ překlad do rep. V tomto případě již nemůže dojít k replikaci.[5]

pSC101: Iteronový plazmid

Iteronové plazmidy, včetně F a RK2 související plazmidy, mají oriV oblasti obsahující více (~ 3-7) opakování 17-22 bp iteronových sekvencí.[3]pSC101 představuje jednoduchý model iteronového plazmidu. Iteronové plazmidy kontrolují počet kopií dvěma kombinovanými metodami, které jsou vhodné pro přísné plazmidy s nízkým počtem kopií. Jednou z metod je kontrola syntézy RepA. RepA je jediný plazmidem kódovaný protein požadovaný pro replikaci v pSC101. RepA protein potlačuje svou vlastní syntézu vazbou na vlastní promotorovou oblast a blokováním transkripce sebe sama (transkripční autoregulace ). Čím více je tedy RepA vyrobeno, tím více je potlačována jeho syntéza a následně omezena replikace plazmidu.[3] Hypotéza vazby navrhuje, že druhou metodou je vazba plazmidů přes Rep protein a iteronové sekvence. Když je koncentrace plazmidu vysoká, vytvářejí RepA plazmidy vázané na iterony dimery mezi dvěma plazmidy, „spoutají“ je na počátku replikace a inhibují replikaci.[6]

Neslučitelnost

Plazmidy mohou být nekompatibilní, pokud sdílejí stejný mechanismus řízení replikace. Za těchto okolností přispívají oba plazmidy k celkovému počtu kopií a jsou regulovány společně. Nejsou rozpoznávány jako odlišné plasmidy. Jako takové se stává mnohem pravděpodobnější, že jeden z plazmidů může být druhým kopírován a ztracen během dělení buněk (buňka je „vyléčena“ z plazmidu).[3] To je zvláště pravděpodobné u plazmidů s nízkým počtem kopií. Plazmidy mohou být také nekompatibilní kvůli sdílení dělící systémy.

Reference

  1. ^ Boros, já; Pósfai, G; Venetianer, P (říjen 1984). "Deriváty s vysokým počtem kopií plazmového klonovacího vektoru pBR322". Gen. 30 (1–3): 257–60. doi:10.1016/0378-1119(84)90130-6. PMID  6096220.
  2. ^ Cesareni, G; Helmer-Citterich, M; Castagnoli, L (1991). "Kontrola replikace plazmidu ColE1 antisense RNA". Trendy v genetice. 7 (7): 230–235. doi:10.1016/0168-9525(91)90370-6. PMID  1887504.
  3. ^ A b C d E Snyder, Larry; Peters, Joseph E .; Henkin, Tina M .; Champness, Wendy (2013). Molekulární genetika bakterií (4. vydání). Stiskněte ASM. ISBN  978-1555816278.
  4. ^ Blomberg, P; Nordström, K; Wagner, E. G. (1992). „Kontrola replikace plazmidu R1: Syntéza RepA je regulována CopA RNA prostřednictvím inhibice translace vedoucího peptidu“. Časopis EMBO. 11 (7): 2675–2683. PMC  556743. PMID  1378398.
  5. ^ Asano, K; Mizobuchi, K (1998). „Kopírování kontroly počtu plazmidu IncIalpha ColIb-P9 kompeticí mezi tvorbou pseudoknotů a antisense RNA vazbou na konkrétním RNA místě“. Časopis EMBO. 17 (17): 5201–5213. doi:10.1093 / emboj / 17.17.5201. PMC  1170848. PMID  9724656.
  6. ^ Kunnimalaiyaan, S; Inman, R. B .; Rakowski, S. A .; Filutowicz, M (2005). „Role π dimerů ve vazbě („ Handcuffing “) γ ori Iteronů plazmidu R6K“. Journal of Bacteriology. 187 (11): 3779–3785. doi:10.1128 / JB.187.11.3779-3785.2005. PMC  1112066. PMID  15901701.