Vektor transformace rostlin - Plant transformation vector - Wikipedia

Vektory transformace rostlin jsou plazmidy které byly speciálně navrženy pro usnadnění tvorby transgenních rostlin. Nejčastěji používané vektory transformace rostlin se nazývají binární vektory kvůli jejich schopnosti replikovat se v obou E-coli běžná laboratorní bakterie a Agrobacterium tumefaciens, bakterie použitá k vložení rekombinantní (přizpůsobené) DNA do rostlin. Transformační vektory rostlin obsahují tři klíčové prvky;

  • Výběr plazmidů (vytvoření vlastního kruhového řetězce DNA)
  • Replikace plazmidů (aby s ní bylo možné snadno pracovat)
  • Přeneste DNA (T-DNA) oblast (vložení DNA do agrobakterií)

Kroky v transformaci rostlin

Propagujte binární vektor v E-coli

Izolovat binární vektor z E-coli a inženýr (představte cizí gen)

Znovu zavést vytvořený binární vektor do E-coli zesílit

Izolovat vytvořený binární vektor a zavést do Agrobakterie obsahující modifikovaný (relativně malý) Ti plazmid

Nakažte rostlinnou tkáň inženýrstvím Agrobakterie (T-DNA obsahující cizí gen se vloží do genomu rostlinné buňky)

V každé buňce se T-DNA integruje na jiném místě v genomu

Poznámka: Existuje mnoho variant těchto kroků. Vlastní DNA plasmidová sekvence může být vytvořena a replikována více než jedním způsobem.

Důsledky vložení

Byla vložena cizí DNA

Inzerční mutageneze (ale ne smrtelná pro rostlinnou buňku - protože organismus je diploidní)

Problém

Chceme transformovat celý organismus, nejen jednu buňku. To se provádí transformací rostlinných buněk v kultuře, výběrem transformovaných buněk a regenerací celé rostliny z transformované buňky (např. Tabák)

Výběr plazmidu

Když jsou bakterie s požadovaným implantovaným genem pěstovány, jsou vyrobeny obsahující selektor. Selektor je způsob, jak izolovat a rozlišit požadované buňky. Gen, díky němuž jsou buňky rezistentní na antibiotikum, jako jsou antibiotika kanamycin, ampicilin, spektinomycin nebo tetracyklin, je snadno použitelný volič. Požadované buňky (spolu s dalšími organismy rostoucími v kultuře) lze ošetřit antibiotikem, což umožňuje přežití požadovaných buněk, zatímco jiné organismy nemohou. Antibiotický gen se obvykle nepřenáší do rostlinné buňky, ale zůstává v bakteriální buňce.

Replikace plazmidů

Plazmidy replikovat za vzniku mnoha molekul plazmidu v každé hostitelské bakteriální buňce. Počet kopií každého plazmidu v bakteriální buňce je určen počátek replikace. Toto je poloha v molekule plazmidů, kde je zahájena replikace DNA. Většina binární vektory mít při replikaci vyšší počet kopií plazmidů E-coli, počet kopií plazmidu je obvykle menší, pokud je plazmid uvnitř Agrobacterium tumefaciens Plazmidy lze replikovat také v polymerázová řetězová reakce (PCR).

Oblast T-DNA

T-DNA obsahuje dva typy genů: onkogenní geny kódující enzymy podílející se na syntéze auxinů a cytokininů a odpovědné za tvorbu nádorů; a geny kódující syntézu opinů. Tyto sloučeniny, vyrobené kondenzací mezi aminokyselinami a cukry, jsou syntetizovány a vylučovány buňkami korunní žluče a konzumovány A. tumefaciens jako zdroje uhlíku a dusíku. Mimo T-DNA jsou umístěny geny pro katabolismus opinů, geny podílející se na procesu přenosu T-DNA z bakterie do rostlinné buňky a geny zapojené do konjugativního přenosu plazmidu bakterie-bakterie. (Hooykaas a Schilperoort, 1992; Zupan a Zambrysky, 1995). Fragment T-DNA je ohraničen přímými repeticemi o 25 bp, které působí jako signál prvku cis pro přenosový aparát. Proces přenosu T-DNA je zprostředkován kooperativním působením proteinů kódovaných geny stanovenými v oblasti virulence Ti plazmidu (virové geny) a v bakteriálním chromozomu. Ti plazmid také obsahuje geny pro opinový katabolismus produkovaný buňkami korunní žlázy a oblasti pro konjugativní přenos a pro svou vlastní integritu a stabilitu. Oblast 30 kb virulence (vir) je regulon organizovaný do šesti operonů, které jsou nezbytné pro přenos T-DNA (virA, virB, virD a virG) nebo pro zvýšení účinnosti přenosu (virC a virE) (Hooykaas a Schilperoort , 1992; Zupan a Zambryski, 1995, Jeon et al., 1998). Různé chromozomálně determinované genetické prvky prokázaly svou funkční roli při připojení A. tumefaciens k rostlinné buňce a bakteriální kolonizaci: loci chvA a chvB, které se podílejí na syntéze a vylučování b -1,2 glukanu (Cangelosi et al ., 1989); chvE vyžadované pro zesílení cukru indukcí virových genů a bakteriální chemotaxi (Ankenbauer et al., 1990, Cangelosi et al., 1990, 1991); lokus cel, odpovědný za syntézu celulózových fibril (Matthysse 1983); lokus pscA (exoC), který hraje svou roli v syntéze jak cyklického glukanu, tak kyselého sukcinoglykanu (Cangelosi et al., 1987, 1991); a att lokus, který se účastní proteinů buněčného povrchu (Matthysse, 1987).

Reference