Koncept: Phage-Assisted Continuous Evolution - Draft:Phage-Assisted Continuous Evolution

Kontinuální vývoj podporovaný fágem (TEMPO) je fág - technika založená na automatizaci řízená evoluce bílkovin. Spoléhá se na spojení požadované aktivity cílového proteinu s vhodností infekčního bakteriofága, který nese odpovídající gen proteinu. Proteiny s vyšší požadovanou aktivitou proto propůjčují svému infekčnímu fágu větší infekčnost. Účinněji se šíří infekčnější fág a vybírá výhodné mutace. Genetická variace je generován pomocí náchylných k chybám polymerázy na fágové vektory a v průběhu času protein akumuluje prospěšné mutace. Tato technika je pozoruhodná pro provádění stovek kol výběru s minimálním zásahem člověka.

Zásada

Ústřední součástí PACE je plavidlo s pevným objemem známé jako „laguna“. Laguna obsahuje M13 bakteriofág vektory nesoucí požadovaný gen (známé jako selekční plazmid nebo SP) a také hostitel E-coli buňky, které umožňují replikaci fága. Laguna se neustále ředí přidáváním a vypouštěním kapalných médií obsahujících E-coli buňky. Průtok kapaliny je nastaven tak, aby rychlost ředění byla rychlejší než rychlost E-coli reprodukce, ale pomalejší než rychlost reprodukce fága. Proto nová nabídka E-coli buňky jsou neustále přítomny v laguně, ale fág lze uchovat pouze prostřednictvím dostatečně rychlé replikace.[1]

Fágová replikace vyžaduje E-coli infekce, která se u fága M13 spoléhá na protein III (pIII).[2] Při použití PACE chybí fágovým vektorům gen pro produkci pIII. Místo toho je produkce pIII spojena s aktivitou sledovaného proteinu prostřednictvím mechanismu, který se liší podle případu použití, často zahrnuje další plazmid obsahující pIII-exprimující gen III (gIII) známý jako pomocný plazmid nebo AP. Zejména produkce šupin infekčních fágů s produkcí pIII.[3] Proto, čím lepší je aktivita proteinu, tím vyšší je rychlost produkce pIII a tím více infekčního fága je generováno pro konkrétní gen.

Použitím polymeráz náchylných k chybám (kódovaných na mutagenezním plazmidu nebo MP) se genetická variace zavede do části proteinového genu fágových vektorů. Kvůli selektivním tlakům aplikovaným neustálým odtokem laguny mohou být v laguně zadrženy pouze fágy, které se mohou replikovat dostatečně rychle, takže se v průběhu času akumulují prospěšné mutace ve fágu replikujícím se v laguně. Tímto způsobem jsou průběžně prováděna kola evoluce, což umožňuje, aby stovky kol proběhly s malým zásahem člověka.[1]

Přehled PACE
Obecné schéma PACE. MP znamená mutagenezní plazmid a kóduje proteiny nezbytné pro zavedení mutací do SP. SP znamená selekční plazmid a kóduje gen bakteriofága M13 minus gIII a také požadovaný gen. AP znamená přídavný plazmid a obsahuje gIII a také způsob indukce transkripce gIII.

Aplikace

Specifičnost promotoru polymerázy

V úvodním článku propagujícím tuto techniku T7 RNA polymerázy byly vyvinuty, aby rozpoznaly různé promotéři, jako jsou promotory T3 nebo SP6.[4] To bylo provedeno tak, že se z cílového promotoru stal jediný promotor pro gIII.[5] Mutantní polymerázy s větší specificitou pro požadovaný promotor tedy způsobily vyšší produkci pIII. To vedlo k polymerázám s ~ 3-4 řády větší aktivitou pro cílový promotor než původní promotor T3.[4]Zatímco tento původní systém PACE prováděl pouze pozitivní výběr, byla vyvinuta varianta, která umožňovala také negativní výběr. To se provádí spojením nežádoucí aktivity s produkcí nefunkčního pIII, což snižuje množství vytvořeného infekčního fága.[6]

PACE na polymerázách
Schéma vývoje specificity polymerázového promotoru pomocí PACE. Mutace obsahující T7 RNAP nepříznivé pro vazbu promotoru T3 nevedou k žádné transkripci gIII. Mutace, které umožňují vazbu na promotor T3, však vedou ke zvýšené transkripci gIII.

Specifičnost proteázového substrátu

Proteázy byly vyvinuty tak, aby štěpily různé peptidy pomocí PACE. V těchto systémech se požadované místo štěpení proteázou používá k propojení T7 RNA polymerázy a T7 lysozym. T7 lysozym zabraňuje T7 polymeráze v transkripci gIII. Když je peptidový linker štěpen, je aktivována T7 polymeráza, což umožňuje transkripci genu pIII. Tato metoda byla použita k vytvoření TEV proteáza s výrazně odlišným peptidovým substrátem.[6][7]

PACE na proteázách
Schéma používání PACE k vývoji aktivity proteázy. Když jsou spojeny T7 RNAP a T7 lysozym, transkripce gIII je blokována. Když je proteáza aktivní pro místo štěpení, uvolní se T7 polymeráza, což umožňuje transkripci gIII.

Ortogonální aminoacyl-tRNA syntetázy

Pomocí PACE, aminoacyl-tRNA syntetázy (aaRS) byly vyvinuty pro nekanonické aminokyseliny také. Aktivita aaRS je spojena s produkcí pIII přidáním stop kodonu TAG uprostřed gIII. Syntetázy, které aminoacylují TAG kodonovou supresorovou tRNA, zabraňují stop kodon aktivita umožňující produkci funkčního pIII. Pomocí tohoto systému byly vyvinuty aaRS, které využívají nekanonické aminokyseliny p-nitro-fenyalanin, jodfenylalanin a Boc-lysin.[8]

PACE na aaRS
Schéma použití PACE k vývoji ortogonálních aminoacyl-tRNA syntetáz. Bez aktivity syntetázy nemůže být T7 RNAP plně přeložen kvůli přítomnosti Amber stop kodonu. Po zavedení funkční syntetázy pro Amber kodonovou tRNA tento Amber stop kodon nyní kóduje nekanonickou aminokyselinu, což umožňuje transkripci úplného T7 RNAP, a tím umožňuje transkripci gIII.

Interakce protein-protein

Interakce protein-protein byly vyvinuty také pomocí PACE. V tomto schématu je cílový protein fúzován s proteinem vázajícím DNA, který se váže na cílovou sekvenci umístěnou před promotorem gIII. Protein procházející evolucí je fúzován s RNA polymerázou. Čím lepší je interakce protein-protein, tím více dochází k transkripci pIII, což umožňuje vývoj interakce protein-protein za podmínek PACE.[6] Tato metoda byla použita k vývoji Bacillus thuringiensis endotoxin varianty, které mohou překonat rezistenci vůči toxinu hmyzu.[6][9]

PACE pro interakce protein-protein
Schéma používání PACE k vývoji interakcí protein-protein. Cílový protein, ve fialové barvě, je fúzován s proteinem vázajícím DNA, modře. Vyvíjející se protein, červeně, je vázán na funkční RNAP, zeleně. Díky tomu, že se protein vázající na DNA váže před promotorem gIII, vede příznivější vazba mezi cílem a vyvíjejícím se proteinem k vyšší transkripci gIII.

Základní editory

K vývoji byl použit PACE APOBEC1 pro lepší rozpustnou expresi. APOBEC1 je cytidindeamináza který našel použití v editorech bází k katalyzování úpravy jednoho nukleotidu C -> T.[10] v E-coli„APOBEC1 obvykle vypadne z roztoku do nerozpustné frakce.[11] Aby se vyvinula APOBEC1 pro lepší rozpustnou expresi, byl N-konec T7 polymerázy fúzován s APOBEC1, přičemž zbývající část polymerázy byla exprimována samostatně. T7 polymeráza může fungovat pouze tehdy, když se N-koncová část může vázat na zbytek polymerázy. Vzhledem k tomu, že APOBEC1 musí být správně složen, aby byla N-koncová část správně vystavena, aktivita T7 polymerázy koreluje s APOBEC1 skládáním. Jak následuje, transkripce a produkce pIII je spojena s rozpustnou expresí APOBEC1 prostřednictvím T7 polymerázy. Použitím tohoto přístupu byla rozpustná exprese APOBEC1 zvýšena čtyřikrát bez změny funkce.[7][9]

PACE pro lepší rozpustnou expresi
Schéma pro inženýrství vyšší rozpustné exprese. POI = požadovaný protein. Když je POI správně složen, je část T7n vystavena, což umožňuje navázání na část T7c pro vytvoření plně funkčního T7 RNAP. Tento T7 RNAP pak může přepsat gIII. Pokud je POI špatně poskládán, pak se T7 RNAP netvoří, což vede k žádné transkripci gIII.

PACE byl také použit k vytvoření katalyticky aktivnější deoxyadenosindeaminázy. Deoxyadenosindeamináza se používá v editorech bází k provádění úpravy jednoho nukleotidu A -> T. To bylo provedeno umístěním adenosin - obsahující stop kodony v genu pro T7 polymerázu. Pokud je základní editor schopen opravit chybu, je produkována funkční T7 polymeráza, což umožňuje produkci pIII. Pomocí tohoto systému vyvinuli deoxyadenosindeaminázu s 590násobnou aktivitou ve srovnání s divokým typem.[12]

PACE pro zvýšenou aktivitu deoxyadenosindeaminázy
Vývoj deoxyadenosindeamináz s vyšší aktivitou pomocí PACE. Gen T7 RNAP zde obsahuje dva stop kodony, oba obsahující adenosinové nukleotidy. Bez aktivity deoxyadenosindeaminázy je výsledný T7 RNAP zkrácen, a proto nefunkční. Avšak s funkční deoxyadenosindeaminázou se stop kodony přemění na kodony kódující aminokyseliny, což umožňuje produkci funkčního T RNAP, který může pokračovat v transkripci gIII.

Reference

  1. ^ A b Esvelt, K .; Carlson, J .; Liu, D.R. (2011). "Systém pro nepřetržitý řízený vývoj biomolekul". Příroda. 472: 499–503. doi:10.1038 / nature09929.
  2. ^ Riechmann, L .; Holliger, P. (1997). „C-terminální doména TolA je coreceptorem pro infekci filamentózními fágy E-coli". Buňka. 90: 351–360. doi:10.1016 / s0092-8674 (00) 80342-6.
  3. ^ Rakonjac, J .; Model, P. (1998). "Role pIII ve vláknité fágové sestavě". J. Mol. Biol. 282: 25–41. doi:10.1006 / jmbi.1998.2006.
  4. ^ A b Lane, M.D .; Seelig, B. (2014). "Pokroky v řízené evoluci proteinů". Curr. Opin. Chem. Biol. 22: 129–136. doi:10.1016 / j.cbpa.2014.09.013.
  5. ^ Lemire, S .; Yehl, K.M .; Lu, T.K. (2018). „Fágové aplikace v syntetické biologii“. Annu. Rev. Virol. 5: 453–476. doi:10.1146 / annurev-virology-092917-043544.
  6. ^ A b C d Brödel, A. K.; Isalan, M .; Jaramillo, A. (2018). "Inženýrství biomolekul evolucí řízenou bakteriofágy". Curr. Opin. Biotech. 51: 32–38. doi:10.1016 / j.copbio.2017.11.004.
  7. ^ A b Kim, J. Y .; Yoo, HW .; Lee, P.G .; Lee, S.G .; Seo, J.H .; Kim, B.G. (2019). "In vivo Evoluce proteinů, strategie příští generace proteinového inženýrství: od náhodného přístupu k cílovému přístupu “. Biotechnol. Bioproc. E. 24: 85–94. doi:10.1007 / s12257-018-0394-2.
  8. ^ Vargas-Rodriguez, O .; Sevostyanova, A .; Söll, D .; Crnković, A. (2018). "Aktualizace aminoacyl-tRNA syntetáz pro rozšíření genetického kódu". Curr. Opin. Chem. Biol. 46C: 115–122. doi:10.1016 / j.cbpa.2018.07.011.
  9. ^ A b Simon, A.J .; d'Oelsnitz, S .; Ellington, A.D. (2018). „Syntetická evoluce“. Nat. Biotechnol. 37: 730–743. doi:10.1038 / s41587-019-0157-4.
  10. ^ Gaudelli, N.M .; Komor, A.C .; Rees, HA; Packer, M.S .; Badran, A.H .; Bryson, D.I .; Liu, D.R. (2017). "Programovatelná základní úprava A · T až G · C v genomové DNA bez štěpení DNA". Příroda. 551: 464–471. doi:10.1038 / příroda24644.
  11. ^ Wang, T .; Badran, A.H .; Huang, T.P .; Liu, D.R. (2018). "Kontinuální řízená evoluce proteinů se zlepšenou rozpustnou expresí". Nat. Chem. Biol. 14: 972–980. doi:10.1038 / s41589-018-0121-5.
  12. ^ Richter, M.F .; Zhao, K.T .; Eton, E .; Lapinaite, A .; Newby, GA; Thuronyi, B.W .; Wilson, C .; Koblan, L.W .; Zeng, J .; Bauer, D.E .; Doudna, J. A.; Liu, D.R. (2020). „Fágový vývoj editoru základny Adenine s vylepšenou kompatibilitou a aktivitou domén Cas“. Nat. Biotechnol. doi:10.1038 / s41587-020-0453-z.