GUIDE-Seq - GUIDE-Seq
![]() | tento článek může být pro většinu čtenářů příliš technická na to, aby je pochopili. Prosím pomozte to vylepšit na aby to bylo srozumitelné pro neodborníky, aniž by byly odstraněny technické podrobnosti. (Říjen 2020) (Zjistěte, jak a kdy odstranit tuto zprávu šablony) |
GUIDE-Seq (Celá genomová, nestranná identifikace DSB povolená sekvenováním) je technika molekulární biologie, která umožňuje nezaujatý in vitro detekce editace mimo cíl genomu události v DNA zapříčiněno CRISPR / Cas9 stejně jako další nukleázy vedené RNA v živých buňkách.[1] Podobně jako u LAM-PCR využívá více PCR amplifikovat oblasti zájmu, které obsahují specifickou vložku, která se přednostně integruje do dvouvláknových zlomů. Jelikož genová terapie je rozvíjející se obor, získal GUIDE-Seq trakci jako levná metoda pro detekci mimotelových účinků potenciálních terapeutik bez nutnosti sekvenování celého genomu.[Citace je zapotřebí ]
Zásady
Koncipován tak, aby fungoval ve shodě s platformami pro sekvenování nové generace, jako je Sekvenování barviv Illumina „GUIDE-Seq spoléhá na integraci tupého, dvouvláknového oligodeoxynukleotidu (dsODN), který byl fosfotiovanizovaný na dvou fosfátových vazbách na 5 'konci obou řetězců.[1] Kazeta dsODN se integruje do jakéhokoli místa v genomu, které obsahuje dvouvláknový zlom (DSB).[1] To znamená, že spolu s cílovými a mimo cílovými místy, která mohou existovat v důsledku aktivity nukleázy, se dsODN kazeta také integruje do jakýchkoli falešných míst v genomu, která mají DSB.[1] Díky tomu je důležité mít podmínku pouze dsODN, která řídí nevyzpytatelné a přirozeně se vyskytující DSB, a je vyžadováno použití bioinformatického potrubí GUIDE-seq.[1]
Po integraci dsODN kazety se z buněčné kultury extrahuje genomová DNA (gDNA) a stříhá se na fragmenty o velikosti 500 bp působením ultrazvuku. Výsledná stříhaná gDNA prochází koncovou opravou a ligací adaptéru. Odtud je DNA specificky obsahující inzert dsODN amplifikována dvěma cykly polymerázové řetězové reakce (PCR), která probíhá jednosměrně, počínaje od primerů, které jsou komplementární k dsODN. Tento proces umožňuje čtení sousedních sekvencí, jak sense, tak anti-sense řetězců, lemujících vložku. Konečným produktem je soubor amplikonů, který popisuje distribuci DSB, obsahuje indexy pro diferenciaci vzorků, adaptéry průtokových buněk p5 a p7 Illumina a sekvence lemující kazetu dsODN.[1]
GUIDE-Seq je schopen dosáhnout detekce vzácných DSB, které se vyskytují s frekvencí 0,1%, může to však být důsledkem omezení sekvenování nové generace platformy. Čím větší hloubky čtení je nástroj schopen dosáhnout, tím lépe dokáže detekovat vzácnější události.[1] Kromě toho je GUIDE-Seq schopen detekovat místa, která nejsou předpovězena metodami „in silico“, které často předpovídají místa na základě podobnosti sekvence a nesouladu procent.[1] Vyskytly se případy, kdy GUIDE-Seq nezjistil žádné off-cíle pro určité naváděcí RNA, což naznačuje, že některé nukleázy s naváděním RNA nemusí mít žádné související off-cíle.[1][2] GUIDE-Seq byl použit k prokázání, že upravené varianty Cas9 mohou mít snížené efekty mimo cíl.[3]
Upozornění
Ukázalo se, že GUIDE-Seq postrádá některé off-cíle, ve srovnání s metodou DIGENOME-Seq sekvenování v celém genomu, vzhledem k povaze jeho cílení.[4] Dalším upozorněním je, že bylo pozorováno, že GUIDE-Seq generuje mírně odlišné off-target stránky v závislosti na buněčné linii.[1] Může to být způsobeno buněčnými liniemi, které mají různý rodičovský genetický původ, mutacemi specifickými pro buněčnou linii, nebo v případě některých nesmrtelných buněčných linií, jako jsou K562, aneuploidií. To naznačuje, že by bylo vhodné, aby vědci testovali více buněčných linií k ověření účinnosti a přesnosti.[Citace je zapotřebí ]
Reference
- ^ A b C d E F G h i j Tsai, Shengdar Q .; Zheng, Zongli; Nguyen, Nhu T .; Liebers, Matthew; Topkar, Ved V .; Thapar, Vishal; Wyvekens, Nicolas; Khayter, Cyd; Iafrate, A. John; Le, Long P .; Aryee, Martin J .; Joung, J. Keith (únor 2015). „GUIDE-seq umožňuje genomové profilování štěpení mimo cíl nukleázami CRISPR-Cas“. Přírodní biotechnologie. 33 (2): 187–197. doi:10.1038 / nbt.3117. PMC 4320685. PMID 25513782.
- ^ Akcakaya, Pinar; Cívka, Maggie L .; Guo, Jimmy A .; Malagon-Lopez, Jose; Clement, Kendell; Garcia, Sara P .; Fellows, Mick D .; Porritt, Michelle J .; Firth, Mike A .; Carreras, Alba; Baccega, Tania; Seeliger, Frank; Bjursell, Mikael; Tsai, Shengdar Q .; Nguyen, Nhu T .; Nitsch, Roberto; Mayr, Lorenz M .; Pinello, Luca; Bohlooly-Y, Mohammad; Aryee, Martin J .; Maresca, Marcello; Joung, J. Keith (12. září 2018). „Úpravy CRISPR in vivo bez detekovatelných off-target mutací v celém genomu“. Příroda. 561 (7723): 416–419. Bibcode:2018Natur.561..416A. doi:10.1038 / s41586-018-0500-9. PMC 6194229. PMID 30209390.
- ^ Kleinstiver, Benjamin P .; Pattanayak, Vikram; Prew, Michelle S .; Tsai, Shengdar Q .; Nguyen, Nhu T .; Zheng, Zongli; Joung, J. Keith (leden 2016). „Vysoce věrné nukleázy CRISPR – Cas9 bez detekovatelných mimocílových účinků na celý genom“. Příroda. 529 (7587): 490–495. Bibcode:2016Natur.529..490K. doi:10.1038 / příroda16526. PMC 4851738. PMID 26735016.
- ^ Kim, Daesik; Kim, Sojung; Kim, Sunghyun; Park, Jeongbin; Kim, Jin-Soo (březen 2016). „Cílové genomové specificity nukleáz CRISPR-Cas9 odhaleny multiplexem Digenome-seq“. Výzkum genomu. 26 (3): 406–415. doi:10.1101 / gr.199588.115. PMC 4772022. PMID 26786045.