Mikroskopie silového spektra - Force spectrum microscopy

Force Spectrum Microscopy (FSM) je aplikace aktivní mikroreologie vyvinutý pro měření agregovaných náhodných sil v cytoplazma.^[1] Velký, inertní sledovače toku se vstřikují do živých buněk a usazují se uvnitř cytoskeletální ok, kde je oscilován dopady z aktivních motorických proteinů. Velikost těchto náhodných sil lze odvodit z frekvence oscilace stopovacích částic. Sledování fluktuací stopovacích částic pomocí optické mikroskopie může izolovat příspěvek aktivních náhodných sil k intracelulárnímu molekulárnímu transportu od přenosu Brownův pohyb.

Základní principy

FSM byl vyvinut společností Ming Guo a David A. Weitz zkoumat stochastické intracelulární síly generované motorickými proteiny.^[1] Daleko od tekuté prázdnoty obsahuje cytoplazma komplexní síť aktin a myosin udělující buňce strukturální podporu a také přístav vezikuly a mitochondrie mimo jiné organely.^[2] Nedávný výzkum na internetu makromolekulární shlukování uvnitř cytoplazmy vyvolává obavy, zda difuzní pohyb velkých molekul byl omylem přičítán Brownovým silám.^[3] Místo toho existují podezření, že myosin motorické proteiny, které náhodně přitahují aktinová vlákna zapuštěná do velkých molekul, způsobují difúzní pohyb molekul uvnitř buněk.^[3][4] Guo a kol. vyvinuli test k rozlišení, zda je pohyb částic uvnitř buněk řízen tepelnou difúzí nebo dopady z aktivních motorických proteinů, jako je nesvalový myosin II, který třese buněčným cytoskeletem.

FSM spoléhá na vstřikování sledovacích částic potažených polyethylenglykol (PEG) větší než velikost ok cytoskeletu (> 50 nm),^[5] usazování mezi sítí aktinových vláken a motorických proteinů myosinu. Protože motorické proteiny myosinu přitahují aktinová vlákna k provádění buněčné práce, tyto fluktuace aktinu vždy oscilují sousední PEGylované částice. Velikost fluktuace sledovače je úměrná velikosti agregovaných aktivních motorových sil. Zaznamenáním posunu stopovacích oscilací tedy FSM může měřit a odvodit velikost sil vyvíjených aktivními motorickými proteiny.^[1]

Měření síly

Výkyvy PEGylovaných stopovacích látek ve spojení s agregovanými myosinovými motorickými silami lze přirovnat k a Hookean jaro,

${ displaystyle F = kx}$

kde síla ${ displaystyle F}$ aplikován na generování posunutí oscilace ${ displaystyle x}$ je úměrná efektivní konstantě pružiny ${ displaystyle k}$ intracelulárního prostředí. Posun během oscilace je prostorová funkce času, kterou lze přímo měřit pomocí optické mikroskopie.^[1] A Fourierova transformace poté mapuje informace v časové doméně do frekvenční domény, aby odvodil užitečnou dimenzi jako funkci frekvence,

${ displaystyle langle left (F (v) right) ^ {2} rangle = langle left (K (v) right) ^ {2} rangle * langle left (x (v) right) ^ {2} rangle}$

kde ${ displaystyle langle left (F (v) right) ^ {2} rangle}$, ${ displaystyle langle left (K (v) right) ^ {2} rangle}$ a ${ displaystyle langle left (x (v) right) ^ {2} rangle}$ jsou kvadratické formy průměrované síly, pružnost a posunutí použité k započítání stochastických sil.^[1] Časově zprůměrováno Střední čtvercový posun, ${ displaystyle MSD = langle left (X (t) right) ^ {2} rangle}$ lze načíst Fourierovou transformací z frekvenční domény zpět do časové domény. V kontextu oscilační frekvence platí, že čím vyšší je silové frekvenční spektrum, tím větší je metabolická aktivita buňky.^[6]Nezávislá mikromechanická měření mohou vypočítat pružnost cytoplazmy. Použitím optická pinzeta k použití předepsané síly na sledovací částici může FSM měřit výsledný posun za účelem odhadu konstanty pružné pružiny.^[7][8]

Aplikace

Cytoplazmatická tekutost

Směrovaná oscilace stopovacích částic pomocí optické pinzety vedla k posunu, který byl téměř synchronizován s aplikovanou silou, což naznačuje, že cytoplazma je materiálně blíže elastické pevné látce.^[1] To je v příkrém kontrastu s předchozí hypotézou, že cytoplazma je viskoelastická tekutina, ve které mohou velké molekuly volně difundovat.^[9] v ATP - buňky s deplecí, ve kterých jsou inaktivovány nesvalové myosiny II, odhalily experimenty FSM, že stopové částice přestávají oscilovat, jako by cytoplazma ztuhla.^[1] Myosin II jsou motorické proteiny, které se vážou a přitahují aktinová vlákna hydrolýzou ATP.^[10] To dále potvrzuje zjištění, že u živin chybí bakterie, cytoplazma přechází do skleněné látky.^[11] Proto se hydrolýza ATP motorickými proteiny jeví jako zásadní pro udržení cytoplazmatické tekutosti, což je zásadní pro transport vezikul a difúzní pohyb v cytoskeletu.^[1]

Diferenciální diagnostika maligního karcinomu

Měřením obecného stavu aktivity uvnitř buňky lze FSM použít k identifikaci zhoubný rakovinné buňky, které jsou charakteristicky pružnější^[12] a pohyblivější. Měření FSM na maligní MCF-7 buňky rakoviny prsu a benigní MCF-10A buňky rakoviny prsu odhalily statisticky významné oddělení silového spektra, které umožňuje FSM testovat metastazující rakovina.^[1] Rozměrnost extracelulárního prostředí velmi ovlivňuje měření FSM rakovinných buněk. V 3D matici MDA-MB-231 metastatické buňky rakoviny prsu měly srovnatelně silnější cytoplazmu než protějšky kultivované na 2D plotnách.^[13]

Reference