Koherentní Ramanova rozptylová mikroskopie - Coherent Raman scattering microscopy

Simultánní dvoubarevný bezbarvový stimulovaný Ramanův rozptyl z-stacku zobrazení ucha myši (červená: protein, zelená: lipid, obraz je 220 x 220 mikronů, celková hloubka je 60 mikronů, doba prodlevy pixelu je 2 mikrosekundy).

Koherentní Ramanův rozptyl (CRS) mikroskopie je technika vícefotonové mikroskopie založená na Raman -aktivní vibrační režimy molekul. Dvě hlavní techniky v CRS mikroskopii jsou stimulovaný Ramanův rozptyl (SRS) a koherentní anti-Stokesův Ramanův rozptyl (AUTA). SRS a CARS byly teoreticky předpovězeny a experimentálně realizovány v 60. letech.^[1][2][3] V roce 1982 byl představen první mikroskop CARS.^[4] V roce 1999 CARS mikroskopie pomocí kolineární geometrie a vysoké numerická clona cíle byly vyvinuty v Xiaoliang Sunney Xie laboratoř na Harvardově univerzitě.^[5] Díky tomuto pokroku byla technika více kompatibilní s moderní laserové skenovací mikroskopy.^[6] Od té doby začala popularita CRS v biomedicínském výzkumu růst. CRS se používá hlavně k zobrazování lipidů, proteinů a dalších biomolekul v živých nebo fixovaných buňkách nebo tkáních bez značení nebo barvení.^[7] CRS lze také použít k zobrazení vzorků označených Ramanovými značkami,^[8][9][10] který může zabránit interferenci s jinými molekulami a normálně umožňuje silnější signály CRS, než jaké by se normálně získaly pro běžné biomolekuly. CRS také nachází uplatnění v jiných oblastech, jako je materiálová věda^[11] vědy o životním prostředí.^[12]

Pozadí

Energetické diagramy spontánních a koherentních Ramanových rozptylových procesů.

Koherentní Ramanův rozptyl je založen na Ramanův rozptyl (nebo spontánní Ramanův rozptyl). U spontánního Ramana se používá pouze jeden monochromatický excitační laser. Intenzita signálu spontánního Ramanova rozptylu roste lineárně s průměrnou silou a laser s kontinuální vlnou. V CRS^[7] dva lasery se používají k buzení konkrétních vibračních režimů zobrazovaných molekul. Laser s vyšší energií fotonu se běžně nazývá pumpový laser a laser s nižší energií fotonu se nazývá Stokesův laser. Aby bylo možné produkovat signál, musí se jejich rozdíly fotonové energie shodovat s energií vibračního režimu:

${ displaystyle E_ {Raman} = E_ {čerpadlo} -E_ {Stokes}}$,

Kde ${ displaystyle E_ {Raman} = hbar Omega, E_ {pump} = hbar omega _ {pump}, E_ {Stokes} = hbar omega _ {Stokes}}$.

CRS je a nelineární optický proces, kde je úroveň signálu obvykle funkcí součinu výkonů čerpadla a Stokesových laserů. Proto se většina experimentů s mikroskopií CRS provádí s pulzní lasery, kde vyšší špičkový výkon významně zlepšil úrovně signálu CRS.^[13]

Koherentní anti-Stokesova Ramanova rozptylová (CARS) mikroskopie

Přední a epi detekovaná AUTA

V CARS jsou anti-Stokesovy fotony (vyšší energie, kratší vlnová délka než čerpadlo) detekovány jako signály.

${ displaystyle E_ {CARS} = E_ {čerpadlo} + Omega = 2 krát E_ {čerpadlo} -E_ {Stokes}}$

V mikroskopii CARS existují obvykle dva způsoby, jak detekovat nově generované fotony. Jeden se nazývá CARS s detekcí vpřed, druhý se nazývá CAR s detekcí epi.^[14][15] U dopředu detekovaných CARS procházejí generované fotony CARS společně s pumpovými a Stokesovými lasery vzorkem. Lasery s pumpou a Stokes jsou zcela blokovány vysokou hladinou optická hustota (OD) zářezový filtr. Fotony CARS jsou poté detekovány a fotonásobič (PMT) nebo a CCD Fotoaparát. V epi detekovaných CARS jsou zpětně rozptýlené fotony CARS přesměrovány a dichroické zrcadlo nebo rozdělovač polarizačního paprsku. Poté, co se k blokování zpětně rozptýleného pumpy a Stokesových laserů použijí filtry s vysokou OD, jsou nově generované fotony detekovány pomocí PMT. Intenzita signálu CARS má následující vztah s intenzitou pumpy a Stokesova laseru ${ displaystyle I_ {pump}, I_ {Stokes}}$, počet molekul ${ displaystyle N}$ v ohnisku laserů a Ramanovy náchylnosti třetího řádu ${ displaystyle chi _ {Raman} ^ {(3)}}$ molekuly:^[16]

${ displaystyle I_ {CARS} propto (N chi _ {Raman} ^ {(3)}) ^ {2} I_ {pump} ^ {2} I_ {Stokes}}$

The odstup signálu od šumu (SNR), což je důležitější charakteristika v zobrazovacích experimentech, závisí na druhé odmocnině počtu generovaných fotonů CARS, který je uveden níže:^[16]

${ displaystyle SNR_ {CARS} propto N chi _ {Raman} ^ {(3)} I_ {pump} { sqrt {I_ {Stokes}}}}$

Existují i ​​jiné nelineární optické procesy, které také generují fotony na anti-Stokesově vlnové délce. Tyto signály se obvykle nazývají nerezonanční (NR) míchání čtyř vln (FWM) pozadí v mikroskopii CARS. Tyto pozadí mohou zasahovat se signálem CARS buď konstruktivně, nebo destruktivně.^[17] Problém však lze částečně obejít odečtením rezonančních a rezonančních obrazů^[18][19] nebo pomocí matematických metod k získání obrázků zdarma na pozadí.^[20]

Stimulovaná Ramanova rozptylová mikroskopie (SRS)

V SRS se intenzita přenosu energie z vlnové délky čerpadla na vlnovou délku Stokesova laseru měří jako signál. Existují dva způsoby, jak měřit signály SRS, jeden je měřit zvýšení výkonu v Stokesově laseru, který se nazývá stimulovaný Ramanův zisk (SRG). Druhým je měření poklesu výkonu v laseru pumpy, který se nazývá stimulovaná Ramanova ztráta (SRL). Vzhledem k tomu, že změna výkonu je řádově 10⁻³ do 10⁻⁶ ve srovnání s původním výkonem čerpadla a Stokesových laserů, schéma modulačního přenosu^[21] se běžně používá k extrakci signálů SRS.^[22] Signál SRS závisí na výkonu čerpadla a laseru Stokes následujícím způsobem:

${ displaystyle I_ {SRS} propto N chi _ {Raman} ^ {(3)} I_ {pump} I_ {Stokes}}$

Hluk výstřelu omezené detekce lze dosáhnout, pokud je elektronický šum z detektorů snížen hluboko pod optický šum a lasery jsou hlukem výstřelu omezeným na detekční frekvenci (modulační frekvence). V případě omezeného šumu výstřelu je poměr signálu k šumu (SNR) SRS^[16] je

${ displaystyle SNR_ {SRL} propto N chi _ {Raman} ^ {(3)} { sqrt {I_ {pump}}} I_ {Stokes}}$

${ displaystyle SNR_ {SRG} propto N chi _ {Raman} ^ {(3)} I_ {pump} { sqrt {I_ {Stokes}}}}$

Signál SRS neobsahuje rezonanční pozadí, které trápí CARS mikroskopii, i když mnohem menší rezonanční pozadí z jiného optického procesu (např. mezifázová modulace, vícebarevný absorpce více fotonů ) může existovat.

SRS lze detekovat buď ve směru vpřed, nebo ve směru epi. V SRS detekovaném dopředu je modulovaný laser blokován zářezovým filtrem s vysokým OD a druhý laser je měřen fotodiodou. Modulace přenesená z modulovaného laseru do původně nemodulovaného laseru je obvykle extrahována a blokovací zesilovač z výstupu fotodiody. V epi-detekovaném SRS existují obvykle dva způsoby detekce signálu SRS. Jednou z metod je detekce zpětně rozptýleného světla před objektivem pomocí fotodiody s otvorem ve středu. Druhá metoda je podobná epi-detekované CARS mikroskopii, kde zpětně rozptýlené světlo prochází objektivem a je vychýleno na stranu světelné dráhy, obvykle s kombinací rozdělovače polarizačního paprsku a čtvrtvlnné desky. Po odfiltrování pumpy (nebo Stokesova laseru) je poté detekován laser Stokes (nebo pumpa).

Dvoubarevná, vícebarevná a hyperspektrální mikroskopie CRS

Jeden pár laserových vlnových délek umožňuje přístup pouze k jedné vibrační frekvenci. Zobrazovací vzorky v různých vlnových číslech mohou poskytnout konkrétnější a kvantitativnější chemické mapování vzorku.^{[23][24][25][26][27][28]} Toho lze dosáhnout zobrazováním na různých vlnových číslech jeden po druhém. Tato operace vždy zahrnuje určitý typ ladění: ladění vlnových délek jednoho z laserů, ladění spektrálního filtračního zařízení nebo ladění časového zpoždění mezi pumpou a Stokesovými lasery v případě spektrálního zaostřování CRS. Dalším způsobem provedení vícebarevného CRS je použití jednoho pikosekundového laseru s úzkou spektrální šířkou pásma (<1 nm) jako pumpy nebo Stokesova a druhého laseru se širokou spektrální šířkou pásma. V tomto případě lze spektrum vysílaného širokopásmového laseru rozšířit mřížkou a měřit pomocí řady detektorů.

Spektrální zaostřování CRS

CRS běžně používají lasery s lasery s úzkou šířkou pásma, jejichž šířka pásma <1 nm, pro udržení dobrého spektrálního rozlišení ~ 15 cm⁻¹. Lasery se šířkou pásma pod 1 nm jsou pikosekundové lasery. Ve spektrálním zaostřování CRS jsou femtosekundová pumpa a Stokesovy lasery stejně lineárně cvrlikal do pikosekundových laserů.^[29][30][31] Efektivní šířka pásma se zmenšuje, a proto lze tímto způsobem dosáhnout vysokého spektrálního rozlišení pomocí femtosekundových laserů, které mají obvykle širokou šířku pásma. Ladění vlnového spektra CRS se spektrálním zaostřováním lze dosáhnout jak změnou středové vlnové délky laserů, tak změnou zpoždění mezi pumpovými a Stokesovými lasery.

Aplikace

Koherentní Ramanova histologie

Jednou z hlavních aplikací pro CRS je histologie bez štítků, která se také nazývá koherentní Ramanova histologie nebo někdy stimulovaná Ramanova histologie.^{[32][33][34][35]} V CRH se obrazy CRS získávají na lipidových a proteinových obrazech a po určitém zpracování obrazu se podobá obrazu Barvení H&E lze získat. Na rozdíl od barvení H&E lze CRH provést na živé a čerstvé tkáni a nepotřebuje fixaci ani barvení.

Buněčný metabolismus

Metabolismus malých molekul, jako je glukóza,^[36] cholesterol,^[37] a drogy^[38] jsou studovány s CRS v živých buňkách. CRS poskytují způsob měření molekulární distribuce a množství s relativně vysokou propustností.

Zobrazování myelinu

Myelin je bohatý na lipidy. CRS se běžně používá ke studiu myelinu v živých nebo fixovaných tkáních ke studiu neurodegenerativní onemocnění nebo jiné nervové poruchy.^[39][40][41]

Farmaceutický výzkum

Funkce léků lze studovat také pomocí CRS. Například lék proti leukémii imatinib jsou studovány pomocí SRS v leukemických buněčných liniích.^[38] Studie odhalila možný mechanismus jeho metabolismu v buňkách a poskytla informace o způsobech, jak zlepšit účinnost léku.

Ramanovy značky

I když CRS umožňuje zobrazování bez štítků, Ramanovy značky lze také použít ke zvýšení signálu pro konkrétní cíle.^[42][9][8] Například deuterované molekuly se používají k posunutí Ramanova signálu do pásma, kde chybí interference z jiných molekul. Speciálně upravené molekuly obsahující izotopy lze použít jako Ramanovy tagy k dosažení super-multiplexního vícebarevného zobrazování pomocí SRS.^[10]

Srovnání s konfokální Ramanovou mikroskopií

Konfokální Ramanova mikroskopie normálně používá kontinuální vlnové lasery k zajištění spontánního Ramanova spektra v širokém rozsahu vln pro každý bod v obraze. Naskenovat celý vzorek trvá dlouho, protože každý pixel vyžaduje pro sběr dat sekundy. Celý proces zobrazování je dlouhý, a proto je vhodnější pro vzorky, které se nepohybují. CRS na druhé straně měří signály na jednom vlnovém čísle, ale umožňuje rychlé skenování. Pokud je zapotřebí více spektrálních informací, lze použít vícebarevný nebo hyperspektrální CRS a rychlost skenování nebo kvalita dat budou odpovídajícím způsobem ohroženy.^[43]

Srovnání mezi SRS a CARS

V CRS mikroskopii můžeme SRS a CARS považovat za dva aspekty stejného procesu. Signál CARS je vždy smíchán s nerezonujícím čtyřvlnným směšovacím pozadím a má kvadratickou závislost na koncentraci zobrazovaných chemikálií. SRS má mnohem menší pozadí a lineárně závisí na koncentraci zobrazené chemikálie. Proto je SRS vhodnější pro kvantitativní zobrazování než CARS. Na straně přístroje vyžaduje SRS modulaci a demodulaci (např. Blokovací zesilovač nebo rezonanční detektor). Pro vícekanálové zobrazování vyžaduje SRS vícekanálovou demodulaci, zatímco CARS potřebuje pouze pole PMT nebo CCD. Proto je požadované vybavení pro SRS komplikovanější než CARS.^[16]

Na straně citlivosti SRS a CARS obvykle poskytují podobnou citlivost.^[44] Jejich rozdíly jsou způsobeny hlavně detekčními metodami. V mikroskopii CARS se PMT, APD nebo CCD používají jako detektory k detekci fotonů generovaných v procesu CARS. PMT se nejčastěji používají kvůli své velké detekční oblasti a vysoké rychlosti. V SRS mikroskopii se fotodiody obvykle používají k měření intenzit laserového paprsku. Z důvodu těchto rozdílů se aplikace CARS a SRS také liší.^[16]

PMT mají obvykle relativně nízkou hodnotu kvantová účinnost ve srovnání s fotodiodami. To negativně ovlivní SNR mikroskopie CARS. PMT mají také sníženou citlivost u laserů s vlnovými délkami delšími než 650 nm. Proto s běžně používaným laserovým systémem pro CRS (Ti-safírový laser ), AUTOMOBILY se používá hlavně k zobrazování v oblasti vysokých vln (2800–3400 cm)⁻¹). Mikroskopie SNR CARS je pro zobrazování otisků prstů obvykle špatná (400–1800 cm)⁻¹).^[16]

Mikroskopie SRS se používá hlavně křemíková fotodioda jako detektory. Si fotodiody mají mnohem vyšší kvantovou účinnost než PMT, což je jeden z důvodů, proč může být SNR SRS v mnoha případech lepší než CARS. Si fotodiody také trpí sníženou citlivostí, pokud je vlnová délka laseru delší než 850 nm. Citlivost je však stále relativně vysoká a umožňuje zobrazování v oblasti otisků prstů (400–1800 cm)⁻¹).^[16]

Viz také

Reference