Životaschopnost PCR - Viability PCR

Pracovní tok životaschopnosti PCR

Životaschopnost PCR, nazývaný také v-PCR nebo vPCR, je vývojem PCR. Pomocí jednoduchého předúpravy vzorku pomocí specifických interkalačních fotoreaktivních činidel je možné neutralizovat DNA mrtvých buněk. Ve výsledku bude pomocí PCR detekována pouze DNA ze živých buněk. Tento přístup značně rozšiřuje analytický rozsah postupů PCR. Schopnost detekovat pouze živé buňky se stává velmi důležitou, protože v klíčových aplikacích je důležitější znát množství živých buněk než celkovou úroveň buněk. Příkladem jsou: kontrola kvality potravin a vody, diagnostika infekčních nemocí, veterinární aplikace, ekologická dynamika ...

První referenční prací o tomto analytickém přístupu byla v roce 2003 norští vědci^[1] navrhnout použití ethidiummonoazidu, azidové formy Ethidiumbromid, který byl použit v jiných analytických oborech jako Průtoková cytometrie jako kandidát na životaschopnost PCR. Hlavní důležité pokroky však učinili Nocker a jeho kolegové, což se projevilo v postupných pracích^[2][3][4][5] potenciál této technologie a také navrhl Propidium monoazid jako lepší činidlo pro vPCR.^[6]

Tato oblast je stále ve vývoji, od roku 2003 do roku 2015 se vědecké důkazy o použitelnosti vPCR skládají, v současné době je hlavní úsilí zaměřeno na optimalizaci postupů. Protože jednoduchá směs reagencií se vzorkem, fotoaktivace a následná PCR ne vždy ukazují očekávané výsledky, vyžaduje každý postup určitou optimalizaci. Doposud byla hlavní vylepšení:

- Zlepšení účinnosti aktivace fotografií: rané postupy byly založeny na vysoce výkonných halogenových žárovkách, které přehřály vzorky a nezajistily konstantní dávku světla, tato domácí řešení byla nahrazena nástroji na bázi ledu.[1][2]

- Použití dlouhých PCR aplikonů jako cílů.^[7]

- Zvýšení teploty během inkubace za tmy.^[8]

Kombinací různých optimalizačních strategií^[9] a řízení analytického zkreslení, v dnešní době se vPCR stává výkonným analytickým nástrojem.

Reference