Terminální aminové izotopové značení substrátů - Terminal amine isotopic labeling of substrates

Terminální aminové izotopové značení substrátů (OCASY) je metoda v kvantitativní proteomika který identifikuje protein obsah vzorků na základě N-terminál fragmenty každého proteinu (N-terminální peptidy ) a detekuje rozdíly v nadbytku bílkovin mezi vzorky.

Stejně jako jiné metody založené na N-koncových peptidech používá tento test trypsin rozbít proteiny na fragmenty a oddělit N-koncové peptidy (fragmenty obsahující N-konce původních proteinů) od ostatních fragmentů (vnitřní tryptické peptidy). TAILS izoluje N-koncové peptidy identifikací a odstraněním vnitřních tryptických peptidů. Tato negativní selekce umožňuje metodě TAILS detekovat všechny N-konce v daných vzorcích. Alternativní metody, které se při identifikaci N-koncových peptidů spoléhají na volnou aminoskupinu N-konce, nemohou detekovat některé N-konce, protože jsou „přirozeně blokovány“ (tj. Přirozený protein nemá volnou aminoskupinu).

Metoda TAILS má řadu aplikací včetně identifikace nových substráty a proteázy (včetně těch, které mají neznámou a širokou specifičnost)[1] a jako způsob definování konců proteinů, který umožňuje anotaci proteinů. TAILS lze také použít k propojení proteáz s řadou definovaných biologických cest u nemocí, jako je rakovina za účelem jasnějšího pochopení substrátů a proteáz zapojených do chorobného stavu.[2]

Metoda

TAILS je 2D nebo 3D proteomický test pro značení a izolaci N-terminálu peptidy, vyvinutý skupinou na University of British Columbia.[1] Metoda TAILS je navržena pro srovnání více buněk ošetřených proteázou a kontrolních proteomových buněk.[2] Vzorky mohou být získány z různých zdrojů, včetně tkání, fibroblastů, rakovinných buněk a z tekutých výpotků.

Tento test izoluje N-koncové peptidy odstraněním vnitřních tryptických peptidů pomocí ultrafiltrace ponechání značených zralých N-koncových a neo-N-koncových peptidů k ​​analýze tandemem hmotnostní spektrometrie (MS / MS). Tato negativní selekce umožňuje metodě TAILS detekovat všechny N-konce v daných vzorcích. Alternativní metody, které se při izolaci N-koncových peptidů spoléhají na volnou aminoskupinu N-konce, nemohou detekovat přirozeně blokované N-konce, protože nemají volnou aminoskupinu.

TAILS vyžaduje pro experimentování pouze malý vzorek peptidu (100–300 ug), lze jej použít s proteázami, které mají neznámou nebo širokou specificitu a podporují různé metody značení vzorků. Identifikuje však ~ 50% proteinů pomocí dvou nebo více různých a jedinečných peptidů (jeden z původního zralého N-konce a / nebo jeden nebo více neo-N-koncových peptidů prostřednictvím štěpného místa), které nepředstavují nezávislé biologické události, a proto nelze průměrovat pro kvantifikaci[je zapotřebí objasnění ]. Rovněž má potíže s validací výsledků pro analýzu N-terminomu na bázi jednoho peptidu[je zapotřebí objasnění ].[1]

Přehled izotopového značení substrátů na terminálním aminu (TAILS)
1
2, 3, 4
5, 6
7
8
9
10
Přehled izotopového značení substrátů na terminálním aminu (TAILS)
Přehled postupu ocasy. Čísla v červené barvě označují kroky v textu.

Následující kroky se týkají testu dimethylace-TAILS, porovnání kontrolního vzorku (vykazujícího normální proteolytickou aktivitu) a ošetřeného vzorku (který v tomto příkladu vykazuje další proteolytickou aktivitu).

  1. Celý protein proteolýza vyskytující se jak v ošetřených, tak v kontrolních vzorcích s další proteolytickou aktivitou v ošetřeném vzorku.
  2. Inaktivace proteáz a denaturace a redukce bílkovin.
  3. Označení stabilními izotopy. To umožňuje odlišit peptidy, které pocházejí z kontrolního vzorku, od peptidů, které pocházejí z ošetřeného vzorku, takže lze porovnat jejich relativní množství. V tomto příkladu se značení aplikuje redukční dimethylací primárních aminů za použití buď těžkého (d (2) C13) -formaldehydu pro ošetřené vzorky nebo lehkého (d (0) C12) -formaldehydu pro kontroly. Tato reakce je katalyzována kyanoborohydridem sodným a váže označené methylové skupiny na lysin-aminy a volné (∝) - aminoskupiny na N-koncích proteinů a produktů štěpení proteázou.
  4. Blokování reaktivních aminoskupin. To umožňuje identifikovat interní tryptické peptidy později v procesu, protože budou jedinými peptidy s reaktivními aminoskupinami. V tomto příkladu značkovací reakce (reduktivní dimethylace) také blokuje reaktivní aminoskupiny.
  5. Sdružování. Dva značené proteomy jsou nyní smíchány. Tím je zajištěno, že se vzorky ve všech následujících krocích zachází stejně, což umožňuje přesnější měření relativního množství proteinů ve dvou vzorcích.
  6. Trypsinizace. Tím se každý protein rozbije na fragmenty. Značené N-konce původních proteinů zůstávají blokovány, zatímco nové vnitřní tryptické peptidy mají volný N-konec.
  7. Negativní výběr. Do vzorku se přidá hyperrozvětvený polymer polyglycerol a aldehyd (HPG) specifický pro vazbu tryptických peptidů a reaguje s nově vytvořenými tryptickými peptidy prostřednictvím jejich volných N-konců. Stejně jako v kroku 3 výše je tato reakce katalyzována kyanoborohydridem sodným. Dimetylované lysinové acetylované a izotopově značené proteinové peptidy a neo (nové) -N-koncové peptidy jsou nereaktivní a zůstávají nevázané a lze je oddělit od komplexů poly-interních tryptických peptidů pomocí ultrafiltrace.
  8. The vymýt nenavázané proteiny jsou vysoce koncentrované s N-koncovými peptidy a neo-N-koncovými peptidy.
  9. Tento eluovaný vzorek je poté kvantifikován a analýza dokončena MS / MS.
  10. Poslední krok v TAILS zahrnuje bioinformatika. Použití hierarchického procesu převíjení substrátu, který odlišuje produkty proteolýzy pozadí a neštěpené proteiny kvantifikací izotopů peptidů a určitými kritérii bioinformatického vyhledávání.[1][2]

Typy

Typy OCASŮ se liší v metodách používaných k blokování a značení aminoskupin proteinů a produktů štěpení proteázou. Tyto aminoskupiny zahrnují lysin-aminy a volné (∝) -amino skupiny N-konců proteinů.

Dimethylační-TAILS postup je postup založený na chemickém značení, který se provádí v jednom kroku za použití amin-reaktivních izotopových reagencií. Označení dvou vzorků používá buď 12CH2-formaldehyd (světlo) nebo 13CD2-formaldehyd (těžký) a jako katalyzátor používá kyanoborohydrid sodný.[1] Výhodou této metody je, že je robustní, efektivní a nákladově efektivní. Postup značení u kontrol a vzorků ošetřených proteázou musí být proveden samostatně, než mohou být sloučeny, a je omezen na dva vzorky na experiment, což může být nevýhodou, pokud je třeba studovat více vzorků současně.[1]

Stabilní izotop značení aminokyselinami v buněčné kultuře (SILAC) je postup, který lze provést in vivo. Tento postup lze použít ve všech laboratořích buněčných kultur a jedná se o rutinně používanou techniku ​​značení. Tento metabolické značení umožňuje inhibici dané proteázy v biologických vzorcích a analýzu ex vivo zpracovává se.[1] Výhodou použití této metody metabolického značení oproti chemickému značení je to, že umožňuje spolehlivou, rychlou a účinnou diskriminaci mezi proteiny odvozenými od skutečných buněk, které jsou vyšetřovány z kontaminantů, jako jsou proteiny v séru. SILAC TAILS lze použít pro analýzu až pěti multiplex Vzorky. SILAC není vhodný pro klinicky relevantní lidské vzorky, které nelze metabolicky označit. SILAC je drahá metoda a pro většinu laboratoří nemusí být proveditelnou volbou.[1]

The izobarická značka pro relativní a absolutní kvantifikaci Metoda (iTRAQ) nebo iTRAQ-TAILS umožňuje kvantifikaci více vzorků současně. Tato metoda má schopnost simultánně analyzovat od 4 do 8 vzorků v multiplexních experimentech s použitím reagencií iTRAQ se čtyřmi a osmi plexy. Tato metoda poskytuje vysokou přesnost identifikace a kvantifikace vzorků a umožňuje reprodukovatelnější analýzu replikátů vzorků.[1] Stejně jako ostatní metody iTRAQ vyžaduje iTRAQ-TAILS hmotnostní spektrometr MALDI a nákladná činidla iTRAQ.

Alternativní metody

Existuje několik alternativních přístupů ke studiu produktů N-konců a proteolýzy.

Acetylace aminů následovaná tryptickým štěpením a biotinylací volných N-koncových peptidů používá chemickou (acetylaci) k označení volných lysinů a N-konců. Blokované N-konce jsou poté negativně vybrány. Přirozeně volné vnitřní N-konce a blokované N-konce však nelze po acetylaci rozlišit. Tato metoda nepoužívá izotopové značení, takže je obtížné kvantifikovat zjištění. Také je těžké rozlišovat mezi experimentálními produkty a produkty proteolýzy pozadí.[3]

Guanidace lysinu následovaná biotinylací N-konců používá chemickou látku k blokování lysinových zbytků a značení volných N-konců. Poté jsou vybrány označené volné N-konce. Nevýhodou této metody je, že nálezy nelze aplikovat na statistický model využívající neštěpené peptidy kvůli tomu, že nejsou schopny zachytit přirozeně blokované N-konce. Protože nezahrnuje izotopové značení, nelze výsledky kvantifikovat. Je také známo, že místo štěpení lze označovat.[4]

Subtiligázová biotinylace N-konců využívá enzymatické značení N-koncových peptidů, ale nepoužívá chemikálie blokující lysin. Bez blokování lysinu bude mnoho štěpeného N-koncového peptidu příliš krátké na identifikaci. Výsledky mohou být vysoce závislé na vlastnostech subtiligázy, takže mohou být zkreslené. Tato metoda nezachycuje přirozeně blokované N-konce a také nepoužívá izotopové značení, takže by bylo obtížné kvantifikovat nálezy.[5]

Označení N-konců ITRAQ používá k označování N-konců iTRAQ. Peptidy Ne-N-konců jsou vybírány in silico. Nevýhodou této techniky je, že je zapotřebí hmotnostní spektrometr MALDI a požadovaná činidla iTRAQ jsou nákladná. Tato metoda nezachycuje přirozeně blokované N-konce. Celý proces bude vyžadovat 50-100 mg peptidových vzorků.[6]

Kombinovaná frakční diagonální chromatografie (COFRADIC) umožňuje různé značení pro přirozeně blokované N-konce a neo-N-konce generované proteázou. Všechny blokované N-konce jsou negativně vybrány. Proces však vyžaduje mnoho chemického zpracování, chromatografie a hmotnostní spektrometrie. Nejlepší výsledky separace závisí na modifikaci aminokyselin, jako je oxidace methioninu, k níž nedochází během manipulace. Tato metoda vyžaduje 150 MS / MS analýz na vzorek, ale vzorky lze shromáždit pro hmotnostní spektrometrii (a počet analýz lze snížit). Tato technika je vhodná pro použití pro proteázy s neznámou nebo širokou specificitou.[7]

Viz také

Reference

  1. ^ A b C d E F G h i Kleifeld, Oded; Doucet, Alain; Prudová, Anna; Auf Dem Keller, Ulrich; Gioia, Magda; Kizhakkedathu, Jayachandran N; Celkově Christopher M (2011). "Identifikace a kvantifikace proteolytických událostí a přirozeného N terminomu pomocí izotopového značení substrátů terminálním aminem". Přírodní protokoly. 6 (10): 1578–611. doi:10.1038 / nprot.2011.382. PMID  21959240.
  2. ^ A b C Kleifeld, Oded; Doucet, Alain; Auf Dem Keller, Ulrich; Prudová, Anna; Schilling, Oliver; Kainthan, Rajesh K; Starr, Amanda E; Foster, Leonard J; et al. (2010). „Izotopové značení terminálních aminů ve složitých vzorcích identifikuje produkty štěpení proteinovými N-konci a proteázou“. Přírodní biotechnologie. 28 (3): 281–8. doi:10.1038 / nbt.1611. PMID  20208520.
  3. ^ McDonald, Lucy; Robertson, Duncan HL; Hurst, Jane L; Beynon, Robert J (2005). „Poziční proteomika: Selektivní výtěžek a analýza N-koncových proteolytických peptidů“. Přírodní metody. 2 (12): 955–7. doi:10.1038 / nmeth811. PMID  16299481.
  4. ^ Timmer, John C .; Enoksson, Mari; Wildfang, Eric; Zhu, Wenhong; Igarashi, Yoshinobu; Denault, Jean-Benard; Ma, Yuliang; Dummitt, Benjamin; et al. (2007). "Profilování konstitutivních proteolytických událostí in vivo". Biochemical Journal. 407 (1): 41–8. doi:10.1042 / BJ20070775. PMC  2267409. PMID  17650073.
  5. ^ Mahrus, Sami; Trinidad, Jonathan C .; Barkan, David T .; Sali, Andrej; Burlingame, Alma L .; Wells, James A. (2008). „Globální sekvenování proteolytických štěpných míst v apoptóze specifickým označením proteinů N Termini“. Buňka. 134 (5): 866–76. doi:10.1016 / j.cell.2008.08.012. PMC  2566540. PMID  18722006.
  6. ^ Enoksson, Mari; Li, Jingwei; Ivancic, Melanie M .; Timmer, John C .; Wildfang, Eric; Eroshkin, Alexey; Salvesen, Guy S .; Tao, W. Andy (2007). "Identifikace proteinových štěpných míst kvantitativní proteomikou". Journal of Proteome Research. 6 (7): 2850–8. doi:10.1021 / pr0701052. PMID  17547438.
  7. ^ Gevaert, Kris; Goethals, Marc; Martens, Lennart; Van Damme, Jozef; Staes, An; Thomas, Grégoire R .; Vandekerckhove, Joël (2003). „Zkoumání proteomů a analýza zpracování proteinů hmotnostní spektrometrickou identifikací tříděných N-koncových peptidů“. Přírodní biotechnologie. 21 (5): 566–9. doi:10.1038 / nbt810. PMID  12665801.