Tac-promotér - Tac-Promoter

Vektor tac pro bakteriální expresi na vysoké úrovni

The Tac-promotér (ve zkratce Ptac), nebo vektor tac je synteticky vyrobená DNA promotér, vyrobený z kombinace promotorů z trp a lac operony.[1] Běžně se používá pro produkce bílkovin v Escherichia coli[2].

Byly zkonstruovány dva hybridní promotory funkční v Escherichia coli. Tyto hybridní promotory, tacI a tacII, byly odvozeny ze sekvencí promotorů trp a lac UV5. V prvním hybridním promotoru (tacI) byla DNA upstream od pozice -20 vzhledem k počátečnímu místu transkripce odvozena od trp promotoru. DNA downstream od pozice -20 byla odvozena od lac UV5 promotoru. Ve druhém hybridním promotoru (tacII) byla DNA upstream od pozice -11 v místě Hpa I v poli Pribnow odvozena od trp promotoru. DNA downstream od pozice -11 je syntetický fragment DNA o 46 párech bází, který specifikuje část hybridního Pribnow boxu a celý lac operátor. Určuje také sekvenci Shine-Dalgarno ohraničenou dvěma jedinečnými restrikčními místy (přenosná sekvence Shine-Dalgarno).

TacI a tacII promotory respektive řídí transkripci přibližně 11 a 7krát účinněji než dereprimovaný rodičovský lac UV5 promotor a přibližně 3 a 2 krát účinněji než trp promotor v nepřítomnosti trp represoru. Oba hybridní promotory mohou být potlačeny lac represorem a oba mohou být dereprimovány isopropyl-beta-D-thiogalaktosidem. V důsledku toho jsou tyto hybridní promotory užitečné pro řízenou expresi cizích genů při vysokých hladinách v E. coli. Na rozdíl od promotorů trp a lac UV5 má promotor tacI nejen konsenzuální sekvenci -35, ale také konsensuální sekvenci Pribnowova pole. To může vysvětlovat vyšší účinnost tohoto hybridního promotoru ve vztahu k jednomu z rodičovských promotorů.[1]

O

Tac promotor se používá k řízení a zvyšování výraz úrovně cílového genu a používá se v nadměrný výraz z rekombinantní proteiny. The tac promotor je pojmenován po dvou promotorech, které tvoří jeho sekvenci:trp 'a' lac„promotéry.

Bakteriální promotéři se skládá ze dvou částí, regionu „-35“ a regionu „-10“ (dále jen Krabice Pribnow ). Tyto dvě oblasti váží faktor sigma z RNA polymeráza, který pak zahájí transkripce následného genu. Promotor tac se skládá z oblasti '-35' v trp promotor a region „-10“ v promotor lac (a liší se od příbuzného promotoru trc o 1 bp[3]). Promotér tac je tedy indukovatelné podle IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalaktopyranosid), přičemž také umožňuje vyšší maximální expresi genu než promotory lac nebo trp. Díky tomu je vhodný pro vysokou účinnost produkce bílkovin rekombinantního proteinu.[1] Silná represe exprese ve stavu „vypnuto“ je důležitá, protože cizí proteiny mohou být pro hostitelskou buňku toxické.

260(6):3539-41.

Aplikace

Pořadatel tac najde různé aplikace. Promotér / operátor tac (dabovaný PTAC) je jedním z nejpoužívanějších expresních systémů. Ptac je silný hybridní promotor složený z -35 oblasti trp promotoru a -10 oblasti lacUV5 promotoru / operátoru. Exprese PTAC je potlačována lacl proteinem. Lakq alela je promotorová mutace, která zvyšuje intracelulární koncentraci LacI represoru, což vede k silné represi PTAC. Přídavek induktoru IPTG deaktivuje LacI represor. Množství exprese z PTAC je tedy úměrné přidané koncentraci IPTG: nízké koncentrace IPTG vedou k relativně nízké expresi z PTAC a vysoké koncentrace IPTG vedou k vysoké expresi z PTAC. Změnou koncentrace IPTG lze měnit množství genového produktu klonovaného po proudu od PTAC v řádu několika řádů.[4] Například systém PTAC se používá pro expresi fúzního proteinu v expresi PMAL-C2X.[5]

Reference

  1. ^ A b C de Boer, H. A .; Comstock, L. J .; Vasser, M. (01.01.1983). „Tac promotor: funkční hybrid odvozený od trp a lac promotorů“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 80 (1): 21–25. doi:10.1073 / pnas.80.1.21. ISSN  0027-8424. PMC  393301. PMID  6337371.
  2. ^ Amann, Egon; Ochs, Birgit; Abel, Karl-Josef (30.09.1988). "Těsně regulované tac promotorové vektory užitečné pro expresi nefúzovaných a fúzovaných proteinů v Escherichia coli". Gen. 69 (2): 301–315. doi:10.1016/0378-1119(88)90440-4. PMID  3069586.
  3. ^ Brosius, J. (1985-03-25). "Rozteč oblastí -10 a -35 v promotoru tac. Účinek na jeho aktivitu in vivo". Journal of Biological Chemistry. 260 (6): 3539–41. PMID  2579077.
  4. ^ Stanley Maloy, profesor, děkan, College of Sciences, náměstek ředitele, Centrum pro mikrobiální vědy, Ph.D. University of California, Irvine. [1][je zapotřebí lepší zdroj ]
  5. ^ Biolabs, New England. "Exprese proteinů vázajících maltózu | NEB". www.neb.com. Citováno 2016-02-26.[je zapotřebí lepší zdroj ]

Viz také