Optické fluktuace se super rozlišením - Super-resolution optical fluctuation imaging

Optické fluktuace se super rozlišením (SOFI) je metoda post-processingu pro výpočet superrozlišených obrazů z časových řad zaznamenaných obrazů, která je založena na časových korelacích nezávisle se měnících fluorescenčních zářičů.

SOFI byl vyvinut pro superrozlišování biologických vzorků, které jsou značeny nezávisle se měnícími fluorescenčními zářiči (organická barviva, fluorescenční proteiny ). Ve srovnání s ostatními mikroskopie s vysokým rozlišením techniky jako BOUŘKA nebo DLAŇ které se spoléhají na lokalizaci jedné molekuly, a proto umožňují pouze jednu aktivní molekulu difrakčně omezená oblast (DLA) a časový bod,^[1][2] SOFI nevyžaduje kontrolované přepínání fotek a / nebo fotoaktivace, stejně jako dlouhé doby zobrazování.^[3][4] Stále však vyžaduje fluorofory, které procházejí dvěma odlišitelnými stavy, buď skutečnými stavy zapnutí / vypnutí nebo stavy s různými intenzitami fluorescence. Z matematického hlediska se SOFI-imaging spoléhá na výpočet kumulanty, pro jaké dva rozlišitelné způsoby existují. Za prvé lze obrázek vypočítat pomocí automatických kumulantů^[3] že se podle definice spoléhají pouze na informace každého pixelu samotného, ​​a pro další věc vylepšená metoda využívá informace různých pixelů prostřednictvím výpočtu křížových kumulantů.^[5] Obě metody mohou výrazně zvýšit konečné rozlišení obrazu, i když výpočet kumulantu má svá omezení. Ve skutečnosti je SOFI schopen zvýšit rozlišení ve všech třech rozměrech.^[3]

Zásada

Princip výpočtu autokumulantu SOFI (A) Schematické znázornění mřížky CCD pixelů obsahující několik signálů vysílače (B) Výřez dvou fluoroforů s jejich signály konvolvovanými s PSF systému zaznamenanými do obrazového zásobníku (C) Signály na každém pixelu jsou vyhodnocovány výpočtem kumulantů (proces, kterému lze porozumět z hlediska korelace a integrace)

Podobně jako u jiných metod superrozlišování je SOFI založen na záznamu časové řady obrazu na kameře CCD nebo CMOS. Na rozdíl od jiných metod může být zaznamenaná časová řada podstatně kratší, protože není nutná přesná lokalizace zářičů, a proto je povoleno větší množství aktivovaných fluoroforů na oblast omezenou difrakcí. Hodnoty pixelů obrazu SOFI obrazu n-tý řád se počítá z hodnot časové řady pixelů ve formě a n-akumulant řádu, zatímco konečnou hodnotu přiřazenou pixelu si lze představit jako integrál nad korelační funkcí. Konečně přidělené intenzity hodnot pixelů jsou měřítkem jasu a korelace fluorescenčního signálu. Matematicky n- kumulant pořadí páté souvisí s nkorelační funkce - řádu, ale vykazuje určité výhody týkající se výsledného rozlišení obrazu. Protože v SOFI je povoleno několik zářičů na DLA, je počet fotonů na každém pixelu výsledkem superpozice signálů všech aktivovaných blízkých zářičů. Výpočet kumulantu nyní filtruje signál a ponechává pouze vysoce korelované fluktuace. To poskytuje vylepšení kontrastu, a tedy redukci pozadí pro dobré měření. Jak je naznačeno na obrázku vlevo, distribuce zdroje fluorescence:

${ displaystyle sum _ {k = 1} ^ {N} delta ({ vec {r}} - { vec {r}} _ {k}) cdot varepsilon _ {k} cdot s_ { k} (t)}$

je zapojen do funkce systému šíření bodů (PSF) U(r). Proto je fluorescenční signál v čase t a poloze ${ displaystyle { vec {r}}}$ darováno

${ displaystyle F ({ vec {r}}, t) = součet _ {k = 1} ^ {N} U ({ vec {r}} - { vec {r}} _ {k}) cdot varepsilon _ {k} cdot s_ {k} (t).}$

V rámci výše uvedených rovnic N je množství zářičů umístěných na pozicích ${ displaystyle { vec {r}} _ {k}}$ s časově závislým molekulárním jasem ${ displaystyle varepsilon _ {k} cdot s_ {k}}$ kde ${ displaystyle varepsilon _ {k}}$ je proměnná pro konstantní molekulární jas a ${ displaystyle s_ {k} (t)}$ je časově závislá fluktuační funkce. Molekulární jas je pouze průměrná rychlost počítání fluorescence dělená počtem molekul v konkrétní oblasti. Pro zjednodušení je třeba předpokládat, že vzorek je ve stacionární rovnováze, a proto lze fluorescenční signál vyjádřit jako nulovou střední fluktuaci:

${ displaystyle delta F ({ vec {r}}, t) = F ({ vec {r}}, t) - langle F ({ vec {r}}, t) rangle _ {t }}$

kde ${ displaystyle langle cdots rangle _ {t}}$ označuje průměrování času. Autokorelace zde např. druhý řád lze poté pro určité časové zpoždění popsat takto deduktivně ${ displaystyle tau}$:

${ displaystyle delta F ({ vec {r}}, t) = langle delta F ({ vec {r}}, t + tau) cdot delta F ({ vec {r}}, t) rangle _ {t}}$

Z těchto rovnic vyplývá, že PSF optického systému je třeba převést na sílu řádu korelace. V korelaci druhého řádu by se tedy PSF snížil ve všech dimenzích faktorem ${ displaystyle { sqrt {2}}}$. Výsledkem je, že rozlišení SOFI obrazů se podle tohoto faktoru zvyšuje.

Kumulanty versus korelace

Používání pouze jednoduché korelační funkce pro opětovné přiřazení hodnot pixelů by připsalo nezávislosti fluktuací emitentů v čase takovým způsobem, že by žádné nové korelační podmínky nepřispěly k nové hodnotě pixelu. Výpočty korelačních funkcí vyššího řádu by trpěly korelacemi nižšího řádu, z jakého důvodu je lepší výpočet kumulantů, protože všechny korelační termíny nižšího řádu zmizí.

Výpočet kumulantu

Automatické kumulanty

Z výpočetních důvodů je vhodné nastavit všechny časové prodlevy v kumulantech vyššího řádu na nulu, takže obecný výraz pro nautokumulant -té objednávky naleznete:^[3]

${ displaystyle AC_ {n} ({ vec {r}}, tau _ {1 ldots n-1} = 0) = součet _ {k = 1} ^ {N} U ^ {n} ({ vec {r}} - { vec {r}} _ {k}) varepsilon _ {k} ^ {n} w_ {k} (0)}$

${ displaystyle w_ {k}}$ je specifická váhová funkce založená na korelaci ovlivněná řádem kumulantu a hlavně v závislosti na fluktuačních vlastnostech zářičů.

Ačkoli při výpočtu velmi vysokých řádů kumulantů neexistuje žádné zásadní omezení, a tím se zmenšuje FWHM PSF, existují praktická omezení podle vážení hodnot přiřazených konečnému obrázku. Vysílače s vyšším jasem molekul vykazují silný nárůst hodnoty pixelové kumulantu přiřazené vyšším řádům, přičemž tento výkon lze očekávat z různého vzhledu fluktuací různých zářičů. Lze tedy očekávat široký rozsah intenzity výsledného obrazu a v důsledku toho mohou být tlumené zářiče maskovány jasnými zářiči v obrazech vyššího řádu :.^[3][5] Výpočet autokumulantů lze provést velmi atraktivně v matematickém smyslu. The n-akumulant -tého řádu lze vypočítat se základní rekurzí z okamžiků^[6]

${ displaystyle K_ {n} ({ vec {r}}) = mu _ {n} ({ vec {r}}) - součet _ {i = 1} ^ {n-1} { začátek {pmatrix} n-1 i end {pmatrix}} K_ {ni} ({ vec {r}}) mu _ {i} ({ vec {r}})}$

kde K je kumulant pořadí indexu, podobně ${ displaystyle mu}$ představuje momenty. Termín v závorkách označuje binomický koeficient. Tento způsob výpočtu je přímý ve srovnání s výpočtem kumulantů se standardními vzorci. Umožňuje výpočet kumulantů pouze s malým časem výpočtu a je, jak je dobře implementováno, dokonce vhodný pro výpočet kumulantů vyššího řádu na velkých obrázcích.

Kumulanty

Principy výpočtu mezikumulantu SOFI a faktor vzdálenosti: (A) Výpočet cross-cumulantu 4. řádu s „kombinacemi s opakováním“. (B) Úpadek faktoru vzdálenosti podél šipek.

V pokročilejším přístupu se křížové kumulanty počítají s přihlédnutím k informacím několika pixelů. Kumulanty lze popsat takto:^[5][7]

${ displaystyle CC_ {n} ({ vec {r}}, tau _ {1 ldots n-1} = 0) = prod _ {j$

j, l a k jsou indexy pro přispívající pixely, zatímco i je index pro aktuální pozici. Všechny ostatní hodnoty a indexy se používají jako dříve. Hlavním rozdílem ve srovnání této rovnice s rovnicí pro autokumulanty je vzhled váhového faktoru ${ displaystyle U (r_ {j} -r_ {l} / { sqrt {n}})}$. Tento váhový faktor (také nazývaný vzdálenostní faktor) má tvar PSF a závisí na vzdálenosti vzájemně korelovaných pixelů v tom smyslu, že příspěvek každého pixelu klesá ve vzdálenosti způsobem PSF. V zásadě to znamená, že faktor vzdálenosti je menší pro pixely, které jsou dále od sebe. Přístup cross-cumulant lze použít k vytvoření nových virtuálních pixelů, které odhalí skutečné informace o označeném vzorku snížením efektivní velikosti pixelu. Tyto pixely nesou více informací než pixely, které vznikají z jednoduché interpolace.

Kromě toho lze k odhadu PSF optického systému použít přístup cross-cumulant s využitím rozdílů v intenzitě virtuálních pixelů, což je způsobeno výše zmíněnou „ztrátou“ vzájemné korelace.^[5] Každý virtuální pixel může být znovu zvážen inverzí faktoru vzdálenosti pixelu, což vede k obnovení skutečné hodnoty kumulantu. Nakonec lze PSF použít k vytvoření závislosti rozlišení n pro nkumulant th-řádu nově zvážením „funkce optického přenosu“ (OTF).^[5] Tento krok lze také nahradit použitím PSF pro dekonvoluci spojenou s nižšími výpočetními náklady.

Mezikumulační výpočet vyžaduje použití výpočetního mnohem nákladnějšího vzorce, který zahrnuje výpočet součtů přes oddíly. To je samozřejmě způsobeno kombinací různých pixelů k přiřazení nové hodnoty. V tomto okamžiku tedy není použitelný žádný rychlý rekurzivní přístup. Pro výpočet křížových kumulantů lze použít následující rovnici:^[8]

${ displaystyle K_ {n} { Bigg (} { vec {r}} = { frac {1} {n}} sum _ {i = 1} ^ {n} { vec {r_ {i} }} { Bigg)} = sum _ {P} (- 1) ^ {| P | -1} (| P | -1)! Prod _ {p v P} { Big langle} prod _ {i in p} F ({ vec {r}}) _ {i} { velký rangle} _ {t}}$

V této rovnici P označuje počet možných oddílů, str označuje různé části každého oddílu. Kromě toho i je index pro různé polohy pixelů, které se berou v úvahu při výpočtu, pro co F je jen zásobník obrázků různých přispívajících pixelů. Přístup cross-cumulant usnadňuje generování virtuálních pixelů v závislosti na pořadí kumulantu, jak bylo uvedeno výše. Tyto virtuální pixely lze vypočítat v určitém vzoru z původních obrazových bodů pro obraz kumulativního obrazu 4. řádu, jak je znázorněno na spodním obrázku, části A. Samotný vzor vychází jednoduše z výpočtu všech možných kombinací původní obrazové pixely A, B, C a D. Zde to bylo provedeno schématem „kombinací s opakováním“. Virtuální pixely vykazují ztrátu intenzity způsobenou samotnou korelací. Část B druhého obrázku zobrazuje tuto obecnou závislost virtuálních pixelů na vzájemné korelaci. Chcete-li obnovit smysluplné hodnoty obrazových bodů, obraz se vyhladí rutinou, která definuje faktor vzdálenosti pro každý pixel mřížky virtuálních pixelů způsobem ve tvaru PSF a použije inverzi na všechny obrazové pixely, které souvisejí se stejným faktorem vzdálenosti.^[5][7]

Reference