Fluorometr Qubit - Qubit fluorometer

Fluorometr Qubit 2.0

The Fluorometr Qubit je laboratorní přístroj vyvinutý a distribuovaný společností Invitrogen (nyní součást Thermo Fisher ), který se mimo jiné používá pro kvantifikaci DNA, RNA, a protein.[1][2][3][4]

Zásada

Qubit fluorometr používá fluorescenční barviva určit koncentraci buď nukleové kyseliny nebo bílkoviny ve vzorku. Další běžnou metodou měření koncentrace nukleových kyselin a bílkovin je metoda UV absorbance, při které se pomocí spektrofotometru měří přirozená absorbance světla při 260 nm (pro DNA a RNA) nebo 280 nm (pro proteiny). Protože tolik molekul absorbuje světlo při 260 nm, je toto měření nepřesné kvůli potenciální kontaminaci vzorku těmito jinými molekulami a není schopno rozlišit mezi DNA, RNA, proteinem nebo volnými nukleotidy nebo aminokyselinami ve vzorku.[5][6][7][8] Na druhou stranu je systém Qubit dodáván s fluorescenčními barvivy, která se specificky vážou na sledované analyty, jako je dvouvláknová DNA (dsDNA), jednořetězcová DNA (ssDNA), RNA, miRNA nebo protein poskytující přesnější kvantifikaci.

Fluorescenční barviva

Hlavní článek: Fluorescence v biologických vědách

Testy Qubit (dříve známé jako Quant-iT) byly vyvinuty a vyrobeny předchozími Molekulární sondy (nyní součást Life Technologies ). Každé barvivo je specifické pro jeden typ molekuly (DNA, RNA nebo protein). Mají extrémně nízká fluorescence dokud se neváže na svou cílovou molekulu. Rozdíl ve fluorescenci mezi vázaným a nevázaným barvivem je několik řádů. Po navázání na DNA pravděpodobně interkalace mezi bázemi nabývají molekuly barviva (PicoGreen) tužšího tvaru a intenzivně fluoreskují.[9][10] Po přidání do roztoku DNA se barvivo Qubit DNA váže na DNA během několika sekund a dosáhne rovnováhy za méně než dvě minuty.

Při specifické koncentraci barviva je intenzita fluorescenčního signálu z této směsi přímo úměrná koncentraci DNA v roztoku, a to i v přítomnosti dalších biomolekul. Fluorometr Qubit zachytí tento fluorescenční signál a převede jej na měření koncentrace DNA odkazem na sondy DNA známé koncentrace. Tento vztah poté použije k výpočtu koncentrace vzorku.

Fluorometr Qubit 2.0 se „soupravou dsDNA BR Assay Kit“

Kvantifikační systém Qubit zahrnuje následující barviva, která jsou specifická pro různé bio-molekuly a koncentrace (ds znamená dvouvláknové, ss pro jednořetězcovou DNA):

Činidlo / testRozsah testuRozsah počáteční koncentrace vzorku
Test Qubit dsDNA HS0,2–100 ng10 pg / μl – 100 ng / μl
Test Qubit dsDNA BR2–1 000 ng100 pg / μl – 1 μg / μl
Test Qubit ssDNA1-200 ng50 pg / ul-200 ng / ul
Test Qubit RNA5–100 ng250 pg / μl – 100 ng / μl
Test Qubit RNA BR20–1 000 ng1 ng / u-1 ug / ul
Test Qubit Protein *0,25–5 μg12,5 μg / ml – 5 mg / ml

Srovnání s jinými zařízeními

Jiné fluorometry mohou také měřit fluorescenci z Qubit barviv a mohou být použity pro kvantifikaci DNA, RNA a proteinů stejným způsobem. Všechny ostatní fluorometry však vyžadují, aby uživatel použil několik standardů DNA a vykreslil koncentraci versus absorbance do grafu. Data musí být poté připojena k přímce a nakonec ke koncentraci vzorku vypočtené z rovnice přímky. Ačkoli se jedná o jednoduchý výpočet pro každého vědce, fluorometr Qubit provádí tento výpočet pro uživatele, takže je rychlejší a jednodušší a navíc je levnější než běžný fluorometr.[Citace je zapotřebí ]

Verze

Druhá generace, fluorometr Qubit 2.0, byla vydána v roce 2010, třetí generace jako Qubit 3.0 v roce 2014. Nejnovější verzí je Qubit 4, který byl uveden na trh v roce 2017.

Reference

  1. ^ Acar E a kol. (2009). „Studie optimalizace a validace sady MentypeR Argus X-8 pro případy otcovství“. Forensic Sci Int Genet Suppl. 2: 47–48. doi:10.1016 / j.fsigss.2009.08.189.
  2. ^ Bakos J a kol. (2009). „Obohacené prostředí ovlivňuje hormonální stav a neurotrofický faktor odvozený od hipokampu z mozku způsobem závislým na pohlaví“. Neurovědy. 164 (2): 788–797. doi:10.1016 / j.neuroscience.2009.08.054. PMID  19723563. S2CID  23809910.
  3. ^ Halaihel N, et al. (2009). „Nový test založený na PCR v reálném čase pro diagnostiku Renibacterium salmoninarum u pstruha duhového (Oncorhynchus mykiss) a srovnání s jinými technikami“. J Microbiol Meth. 76 (1): 75–80. doi:10.1016 / j.mimet.2008.09.014. PMID  18938198.
  4. ^ Hamza IA a kol. (2009). „Detekce a kvantifikace lidského bocaviru v říční vodě“. J Gen Virol. 90 (Pt 11): 2634–2637. doi:10.1099 / vir.0.013557-0. PMID  19656966.
  5. ^ Manchester, K.L. (1996). „Použití UV metod pro měření koncentrací proteinů a nukleových kyselin“. Biotechniky. 20 (6): 968–970. doi:10.2144 / 96206bm05. PMID  8780864.
  6. ^ Glasel, J.A. (1995). "Validita čistoty nukleových kyselin monitorována absorbčními poměry 260 nm / 280 nm". Biotechniky. 18 (1): 62–63. PMID  7702855.
  7. ^ Huberman, J.A. (1995). "Důležitost měření absorbance nukleových kyselin při 240 nm a při 260 a 280 nm". Biotechniky. 18 (4): 636. PMID  7598897.
  8. ^ Manchester, K.L. (1995). "Hodnota poměrů A260 / A280 pro měření čistoty nukleových kyselin". Biotechniky. 19 (2): 208–210. PMID  8527139.
  9. ^ McKnight, R.E., Gleason, A.B., Keyes, J.A., Sahabi, S. (2006). „Vazebný režim a afinitní studie činidel vázajících DNA pomocí testu odvíjení DNA topoizomerázy I“. Dopisy o bioorganické a léčivé chemii. 17 (4): 1013–1017. doi:10.1016 / j.bmcl.2006.11.038. PMID  17157016.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)
  10. ^ Schweitzer, C., Scaiano, J. C. (2003). „Selektivní vazba a lokální fotofyzika fluorescenčního cyaninového barviva PicoGreen ve dvouvláknové a jednovláknové DNA“. Fyzikální chemie Chemická fyzika. 5 (21): 4911–4917. doi:10.1039 / b305921a.CS1 maint: více jmen: seznam autorů (odkaz)

externí odkazy