Jaderný záběh - Nuclear run-on

A nukleární rozběh se provádí k identifikaci geny které jsou přepsal v určitém časovém bodě. Přibližně jeden milion buněčná jádra se izolují a inkubují se značenými nukleotidy a geny v procesu transkripce jsou detekovány hybridizací extrahované RNA na genově specifické sondy na a skvrna.[1] Garcia-Martinez a kol. (2004) [2] vyvinuli protokol pro kvasinky S. cerevisiae (Genomic run-on, GRO), který umožňuje výpočet rychlostí transkripce (TRs) pro všechny kvasinkové geny pro odhad stability mRNA pro všechny kvasinkové mRNA.[3]

Nedávno byly vyvinuty alternativní metody microarray, zejména PolII RIP čip: Imunoprecipitace RNA RNA polymerázy II s fosforylovanými protilátkami zaměřenými na C-terminální doménu a hybridizaci na mikroarray sklíčku nebo čipu (slovo chip v názvu pochází z „ChIP-chip“, kde speciální Affymetrix GeneChip). Srovnání metod založených na run-on a ChIP-chipu bylo provedeno v kvasnicích (Pelechano et al., 2009). Byla zjištěna obecná korespondence obou metod, ale GRO je citlivější a kvantitativnější. Je třeba vzít v úvahu, že náběh detekuje pouze prodlužující se RNA polymerázy, zatímco čip ChIP detekuje všechny přítomné RNA polymerázy, včetně zpětně navázaných.

Přehled globálního testu sekvenování pro vymezení genů v celém genomu, které se účastní transkripce.

Připojení nové RNA polymerázy ke genům je zabráněno zahrnutím sarkosyl. Proto pouze geny, které již mají RNA polymerázu, budou produkovat značené transkripty. RNA transkripty, které byly syntetizovány před přidáním značky, nebudou detekovány, protože jim bude značka chybět. Tyto běhy na transkriptech lze také detekovat čištěním značených transkriptů pomocí protilátek, které detekují značku, a hybridizací těchto izolovaných transkriptů s poli genové exprese nebo sekvenováním další generace (GRO-Seq).[4]

Testy Run on Assays byly do značné míry nahrazeny testy Global Run on Assays, které využívají sekvenování DNA nové generace jako zobrazovací platformu. Tyto testy jsou známé jako GRO-Seq a poskytnout neuvěřitelně detailní pohled na geny zapojené do transkripce s kvantitativními úrovněmi exprese. Metody založené na poli pro analýzu testů Global run on (GRO) jsou nahrazeny sekvenováním nové generace, které eliminuje návrh sond proti genovým sekvencím. Sekvenování katalogizuje všechny vytvořené přepisy, i když nejsou uvedeny v databázích. GRO-seq zahrnuje značení nově syntetizovaných transkriptů bromouridinem (BrU). Buňky nebo jádra se inkubují s BrUTP v přítomnosti sarkosyl, který brání připojení RNA polymerázy k DNA. Proto pouze RNA polymeráza, která je již na DNA před přidáním sarkosylu, vytvoří nové transkripty, které budou označeny BrU. Značené transkripty jsou zachyceny kuličkami značenými anti-BrU protilátkou, převedeny na cDNA a poté sekvenovány sekvenováním DNA další generace. Sekvenční čtení jsou poté srovnána s genomem a počet čtení na transkript poskytuje přesný odhad počtu syntetizovaných transkriptů.[5]

Reference

  1. ^ Gariglio, P; Bellard, M; Chambon, P (červen 1981). "Shlukování molekul RNA polymerázy B v 5 'části dospělého genu beta-globinu slepičích erytrocytů". Nucleic Acids Res. 9 (11): 2589–98. doi:10.1093 / nar / 9.11.2589. PMC  326874. PMID  6269056.
  2. ^ García-Martínez, J; Aranda, A; Pérez-Ortín, JE (2004). „Genomic run-on hodnotí transkripční rychlosti pro všechny kvasinkové geny a identifikuje regulační mechanismy genů“. Mol. Buňka. 15 (2): 303–13. doi:10.1016 / j.molcel.2004.06.004. hdl:10550/32058. PMID  15260981.
  3. ^ Pelechano, V; Jimeno-González, S; Rodríguez-Gil, A; García-Martínez, J; Pérez-Ortín, JE; Chávez, S (srpen 2009). „Regulonově specifické řízení prodloužení transkripce napříč genomem kvasinek“. PLoS Genet. 5 (8): e1000614. doi:10.1371 / journal.pgen.1000614. PMC  2721418. PMID  19696888.
  4. ^ Core, L; Vodopád, J; Lis, JT (2008). „Vznikající RNA sekvenování odhaluje rozsáhlé pozastavení a divergentní zahájení u lidských promotorů“. Věda. 322 (5909): 1845–8. doi:10.1126 / science.1162228. PMC  2833333. PMID  19056941.
  5. ^ Min, IM; Waterfall, JJ; Core, LJ; Munroe, RJ; Schimenti, J; Lis, JT (duben 2011). „Regulace pozastavení RNA polymerázy a prodloužení transkripce v embryonálních kmenových buňkách“. Genes Dev. 25 (7): 742–54. doi:10.1101 / gad.2005511. PMC  3070936. PMID  21460038.