Živé jednobuněčné zobrazování - Live single-cell imaging - Wikipedia

v biologie systémů, živé jednobuněčné zobrazování je zobrazení živých buněk technika, která kombinuje tradiční zobrazování živých buněk a časosběrná mikroskopie techniky s automatizovaným sledováním buněk a extrakcí funkcí, čerpající z mnoha technik vysoce obsahový screening. Používá se ke studiu dynamiky a chování signalizace v populacích jednotlivých živých buněk.[1][2] Živé studie jednotlivých buněk mohou odhalit klíčové chování, které by jinak bylo maskováno v populačních průměrných experimentech, jako je západní bloty.[3]

V zobrazovacím experimentu s živou jednou buňkou se do buněčné linie zavede fluorescenční reportér pro měření hladin, lokalizace nebo aktivity signální molekuly. Následně je populace buněk v průběhu času zobrazována s pečlivou atmosférickou kontrolou, aby byla zachována životaschopnost a snížen stres na buňky. Na těchto obrázcích časových řad se poté provede automatické sledování buněk, po kterém lze provést filtrování a kontrolu kvality. Analýza vlastností popisujících fluorescenční reportér v průběhu času pak může vést k modelování a generování biologických závěrů, z nichž lze vyvodit další experimenty.

Dějiny

Pole živého zobrazování jednotlivých buněk začalo prací, která to demonstrovala zelený fluorescenční protein (GFP), nalezený v medúzách Aequorea victoria, lze vyjádřit v živých organismech.[4] Tento objev umožnil výzkumům studovat lokalizaci a hladiny proteinů v živých jednotlivých buňkách, například aktivitu kinázy,[5] a vápník úrovně, pomocí FRET reportéři,[6] stejně jako mnoho dalších fenotypů.[7]

Obecně se tyto rané studie zaměřovaly na lokalizaci a chování těchto fluorescenčně značených proteinů na subcelulární úrovni po krátkou dobu. To se však změnilo průkopnickými studiemi zabývajícími se potlačováním nádorů p53[8] a protein související se stresem a zánětem NF-kB,[9] odhalil tam úrovně a lokalizaci, aby osciloval po dobu několika hodin. V této době byly také použity živé jednobuněčné přístupy k pochopení signalizace v jednobuněčných organismech včetně bakterií, kde živé studie umožnily modelování dynamiky kompetencí,[10] a kvasinky odhalující mechanismus podporující vstup koherentního buněčného cyklu.[11]

Průběh experimentální práce

Fluorescenční reportéři

V jakékoli živé studii s jednou buňkou je prvním krokem zavedení reportéru pro náš sledovaný protein / molekulu do vhodné buněčné linie. Velká část růstu v této oblasti pochází z vylepšených nástrojů pro úpravu genů, jako je CRISPR, což vedlo k vývoji široké škály fluorescenčních reportérů.[12]

Fluorescenční značení používá gen kódující fluorescenční protein, který je vložen do kódovacího rámce proteinu, který má být označen. Textury a rysy intenzity lze extrahovat ze snímků označeného proteinu.

Molekuly lze také označit in vitro a zaveden do buňky s elektroforéza. To umožňuje použití menších a fotostabilnějších moudrů, ale vyžaduje další promývací kroky.[13]

Inženýrskou expresí reportéru FRET tak, že fluorofory donor a emitor jsou pouze v těsné blízkosti, když je signální molekula proti směru toku aktivní nebo neaktivní, lze jako měřítko signální aktivity použít poměr intenzity fluorescence dárce k emitoru. Například v klíčové rané práci využívající reportéry FRET pro živé jednotlivé studie FRET reportéři Rho GTPáza byla vytvořena aktivita.[14]

Reportéři nukleární translokace používají inženýrství jaderný dovoz a jaderný export signály, které mohou být inhibovány signálními molekulami, k záznamu signalizační aktivity pomocí poměru jaderného reportéra k cytoplazmatickému reportéru.[15]

Živé zobrazování

Poté musí být provedeno zobrazení živých buněk fluorescenčně značených buněk. To vyžaduje současnou inkubaci buněk v podmínkách bez stresu, zatímco se provádí zobrazování. Při výběru zobrazovacích podmínek je třeba vzít v úvahu několik faktorů, jako je fototoxicita, fotobělení, snadnost sledování, rychlost změny signalizační aktivity a signál k šumu. To vše souvisí s frekvencí zobrazování a intenzitou osvětlení.

Fototoxicita může být výsledkem dlouhodobého vystavení velkému množství světla. Buňky budou stresovány, což může vést k apoptóze. Vysokofrekvenční a intenzivní zobrazování může způsobit pokles fluoroforového signálu fotobělením. Vysokofrekvenční zobrazování obecně usnadňuje automatické sledování buněk. Zobrazovací frekvence by měly být schopny zachytit nezbytné změny signalizační aktivity. Nízká intenzita zobrazování nebo špatní reportéři mohou zabránit detekci nízké úrovně signalizační aktivity v buňce.

Živé sledování buněk

Po zobrazování živých buněk se poté použije software pro automatické sledování k extrakci dat časových řad z videí buněk. Sledování živých buněk je obecně rozděleno do dvou kroků, segmentace obrazu buněk nebo jejich jader a sledování buněk / jader na základě těchto segmentů. V této fázi živé zobrazovací studie s jednou buňkou stále existuje mnoho výzev.[16] Nedávný pokrok však byl zdůrazněn v prvním objektivním srovnání technik sledování jednotlivých buněk v terénu.[17]

Kvantitativní fázové zobrazování (QPI) je zvláště užitečný pro sledování živých buněk. Jelikož QPI je bez značek, neindukuje fototoxicitu ani netrpí fotobělením spojeným s fluorescenčním zobrazováním.[18] QPI nabízí výrazně vyšší kontrast než konvenční techniky fázového zobrazování, jako je např mikroskopie s fázovým kontrastem. Vyšší kontrast umožňuje robustnější segmentaci a sledování buněk, než jaké lze dosáhnout při konvenčním fázovém zobrazování.[19]

Rovněž se stále více používají nové techniky, které využívají kombinaci tradičních technik segmentace obrazu a hlubokého učení segmentace buněk.[20]

Analýza dat

V závěrečné fázi živé jednobuněčné zobrazovací studie se provádí modelování a analýza dat časových řad extrahovaných ze sledovaných buněk. Profily rodokmenů mohou být konstruovány tak, aby odhalily heterogenitu v reakci jednotlivých buněk a následné signalizaci.[21] Velké překrývání mezi analýzou živých dat jednotlivých buněk a modelováním použití biologických systémů obyčejné diferenciální rovnice existuje. Výsledky tohoto klíčového kroku analýzy dat podpoří další experimentování, například rušením aspektů studovaného systému a poté porovnáním dynamiky signalizace s dynamikou kontrolní populace.

Aplikace

Analýzou dynamiky signalizace jednotlivých buněk napříč celou populací nám nyní živé jednobuněčné studie umožňují pochopit, jak tato dynamika ovlivňuje klíčové buněčné rozhodovací procesy. Například živé jednobuněčné studie růstového faktoru ERK odhalil, že má digitální aktivaci vše nebo nic.[22] Navíc byla tato aktivace všeho nebo nic pulzující a frekvence pulzů zase určovala, zda by se savčí buňky zavázaly ke vstupu do buněčného cyklu nebo ne. V dalším klíčovém příkladu jsou živé jednobuněčné studie CDK2 aktivita v savčích buňkách prokázala, že bifurkace v aktivitě CDK2 po mitóze určila, zda by buňky pokračovaly v proliferaci nebo do klidového stavu;[23] nyní ukázáno, s použitím živých jednobuněčných metod, že je způsobeno stochastickým poškozením DNA vyvolávajícím regulaci p21, který inhibuje aktivitu CDK2.[24] Do budoucna budou nyní živé studie s jednou buňkou pravděpodobně spolupracovat s více reportéry do jednotlivých buněčných linií, aby bylo možné porozumět složitým rozhodovacím procesům, avšak při rozšiřování studií s jednou buňkou v reálném čase stále přetrvávají problémy.

Reference

  1. ^ Gaudet, Suzanne; Miller-Jensen, Kathryn (2016). „Předefinování signálních cest pomocí rozšiřujícího se nástroje pro jednotlivé buňky“. Trendy v biotechnologii. 34 (6): 458–469. doi:10.1016 / j.tibtech.2016.02.009. PMC  4958913. PMID  26968612.
  2. ^ Cooper, Sam; Bakal, Chris (2017). "Zrychlení živých jednobuněčných signálních studií". Trendy v biotechnologii. 35 (5): 422–433. doi:10.1016 / j.tibtech.2017.01.002. PMID  28161141.
  3. ^ Purvis, Jerem E .; Lahav, Galit (2013). „Kódování a dekódování celulárních informací pomocí dynamiky signalizace“. Buňka. 152 (5): 945–956. doi:10.1016 / j.cell.2013.02.005. PMC  3707615. PMID  23452846.
  4. ^ Chalfie, Martin. „Zelený fluorescenční protein jako marker genové exprese.“ Trends in Genetics 10.5 (1994): 151.
  5. ^ Ng, T. (1999). "Zobrazování aktivace proteinkinázy C v buňkách". Věda. 283 (5410): 2085–2089. Bibcode:1999Sci ... 283.2085N. doi:10.1126 / science.283.5410.2085. PMID  10092232.
  6. ^ Tsien, Roger Y .; Miyawaki, Atsushi; Llopis, Juan; Heim, Roger; McCaffery, J. Michael; Adams, Joseph A .; Ikura, Mitsuhiko (1997). "Fluorescenční indikátory pro Ca2 + na základě zelených fluorescenčních proteinů a kalmodulinu". Příroda. 388 (6645): 882–887. Bibcode:1997 Natur.388..882M. doi:10.1038/42264. PMID  9278050. S2CID  13745050.
  7. ^ Tsien, R. Y. (1998). „BIOCHEMICKÉ ZOBRAZOVÁNÍ: Pohled na strojní zařízení živých buněk“. Věda. 280 (5371): 1954–1955. doi:10.1126 / science.280.5371.1954. PMID  9669950. S2CID  1666177.
  8. ^ Lahav, Galit; Rosenfeld, Nitzan; Sigal, Alex; Geva-Zatorsky, Naama; Levine, Arnold J.; Elowitz, Michael B; Alon, Uri (2004). "Dynamika zpětnovazební smyčky p53-Mdm2 v jednotlivých buňkách". Genetika přírody. 36 (2): 147–150. doi:10.1038 / ng1293. PMID  14730303.
  9. ^ Nelson, D. E. (2004). "Oscilace v NF-kB signalizaci řídí dynamiku genové exprese". Věda. 306 (5696): 704–708. doi:10.1126 / science.1099962. PMID  15499023. S2CID  86055964.
  10. ^ Süel, Gürol M .; Garcia-Ojalvo, Jordi; Liberman, Louisa M .; Elowitz, Michael B. (2006). „Excitabilní genový regulační obvod indukuje přechodnou buněčnou diferenciaci“ (PDF). Příroda. 440 (7083): 545–550. Bibcode:2006 Natur.440..545S. doi:10.1038 / nature04588. PMID  16554821. S2CID  4327745.
  11. ^ Skotheim, Jan M .; Talia, Stefano Di; Siggia, Eric D .; Kříž, Frederick R. (2008). „Pozitivní zpětná vazba cyklinů G1 zajišťuje koherentní vstup buněčného cyklu“. Příroda. 454 (7202): 291–296. Bibcode:2008 Natur.454..291S. doi:10.1038 / nature07118. PMC  2606905. PMID  18633409.
  12. ^ Sharma, Arun; Toepfer, Christopher N .; Ward, Tarsha; Wasson, Lauren; Agarwal, Radhika; Conner, David A .; Hu, Johnny H .; Seidman, Christine E. (2018-01-24). „Fluorescenční značení endogenních proteinů v lidských pluripotentních kmenových buňkách zprostředkované CRISPR / Cas9“. Současné protokoly v lidské genetice. 96: 21.11.1–21.11.20. doi:10,1002 / cphg.52. ISSN  1934-8266. PMC  5785097. PMID  29364519.
  13. ^ Crawford, Robert; Torella, Joseph P .; Aigrain, Louise; Plochowietz, Anne; Gryte, Kristofer; Uphoff, Stephan; Kapanidis, Achillefs N. (03.12.2013). „Intracelulární fluorescence s jednou molekulou s dlouhou životností s využitím elektroporovaných molekul“. Biofyzikální deník. 105 (11): 2439–2450. Bibcode:2013BpJ ... 105.2439C. doi:10.1016 / j.bpj.2013.09.057. ISSN  0006-3495. PMC  3853080. PMID  24314075.
  14. ^ Pertz, Olivier; Hodgson, Louis; Klemke, Richard L .; Hahn, Klaus M. (2006). "Prostoročasová dynamika aktivity RhoA v migrujících buňkách". Příroda. 440 (7087): 1069–1072. Bibcode:2006 Natur.440.1069P. doi:10.1038 / nature04665. PMID  16547516. S2CID  4401450.
  15. ^ Regot, Sergi; Hughey, Jacob J .; Bajar, Bryce T .; Carrasco, Silvia; Covert, Markus W. (2014). „Měření vysoké citlivosti více aktivit kinázy v živých jednotlivých buňkách“. Buňka. 157 (7): 1724–1734. doi:10.1016 / j.cell.2014.04.039. PMC  4097317. PMID  24949979.
  16. ^ Skylaki, Stavroula; Hilsenbeck, Oliver; Schroeder, Timm (2016). „Výzvy v dlouhodobém zobrazování a kvantifikaci dynamiky jedné buňky“. Přírodní biotechnologie. 34 (11): 1137–1144. doi:10.1038 / nbt.3713. PMID  27824848. S2CID  17548070.
  17. ^ Maska, M .; Ulman, V .; Svoboda, D .; Matula, P .; Matula, P .; Ederra, C .; Urbiola, A .; Espana, T .; Venkatesan, S .; Balak, D. M. W .; Karas, P .; Bolckova, T .; Streitova, M .; Carthel, C .; Coraluppi, S .; Harder, N .; Rohr, K .; Magnusson, K. E. G .; Jalden, J .; Blau, H. M .; Dzyubachyk, O .; Křížek, P .; Hagen, G. M .; Pastor-Escuredo, D .; Jimenez-Carretero, D .; Ledesma-Carbayo, M. J .; Munoz-Barrutia, A .; Meijering, E .; Kozubek, M .; Ortiz-de-Solorzano, C. (2014). „Měřítko pro srovnání algoritmů pro sledování buněk“. Bioinformatika. 30 (11): 1609–1617. doi:10.1093 / bioinformatika / btu080. PMC  4029039. PMID  24526711.
  18. ^ Park, YongKeun; Depeursinge, Christian; Popescu, Gabriel (27. září 2018). "Kvantitativní fázové zobrazování v biomedicíně". Fotonika přírody. 12 (10): 578–589. Bibcode:2018NaPho..12..578P. doi:10.1038 / s41566-018-0253-x. PMID  26648557. S2CID  126144855.
  19. ^ Kasprowicz, Richard; Suman, Rakesh; O’Toole, Peter (1. března 2017). „Charakterizace chování živých buněk: tradiční přístupy bez kvantifikace a kvantitativního fázového zobrazování“. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84: 89–95. doi:10.1016 / j.biocel.2017.01.004. ISSN  1357-2725. PMID  28111333.
  20. ^ Wang, Weikang; Taft, David A .; Chen, Yi-Jiun; Zhang, Jingyu; Wallace, Callen T .; Xu, min; Watkins, Simon C .; Xing, Jianhua (květen 2019). „Naučte se segmentovat jednotlivé buňky pomocí nástroje pro odhad hloubky vzdálenosti a detektoru hlubokých buněk“. Počítače v biologii a medicíně. 108: 133–141. doi:10.1016 / j.compbiomed.2019.04.006. ISSN  1879-0534. PMC  6781873. PMID  31005005.
  21. ^ Korsnes, Mónica S .; Korsnes, Reinert (2018). „Sledování jedné buňky buněk A549 proti rakovině plic vystavených mořskému toxinu odhaluje korelace v profilech rodokmenů“. Hranice v onkologii. 8: 260. doi:10.3389 / fonc.2018.00260. PMC  6039982. PMID  30023341.
  22. ^ Albeck, John G .; Mills, Gordon B .; Brugge, Joan S. (2013). „Frekvenčně modulované impulzy aktivity ERK vysílají kvantitativní signály šíření“. Molekulární buňka. 49 (2): 249–261. doi:10.1016 / j.molcel.2012.11.002. PMC  4151532. PMID  23219535.
  23. ^ Spencer, Sabrina L .; Cappell, Steven D .; Tsai, Feng-Chiao; Overton, K. Wesley; Wang, Clifford L .; Meyer, Tobias (2013). „Rozhodnutí o proliferaci - klid je řízeno bifurkací v aktivitě CDK2 na mitotickém východu“. Buňka. 155 (2): 369–383. doi:10.1016 / j.cell.2013.08.062. PMC  4001917. PMID  24075009.
  24. ^ Barr, Alexis R .; Cooper, Samuel; Heldt, Frank S .; Butera, Francesca; Stoy, Henriette; Mansfeld, Jorg; Novak, Bela; Bakal, Chris (2017). „Poškození DNA během S-fáze zprostředkovává rozhodnutí proliferace - klid v následující G1 prostřednictvím exprese p21“. Příroda komunikace. 8: 14728. Bibcode:2017NatCo ... 814728B. doi:10.1038 / ncomms14728. PMC  5364389. PMID  28317845.