Hybridizace in situ - In situ hybridization

RNA in situ hybridizace - KRT5 a udržovací gen u člověka melanom FFPE tkáňový řez - vizualizován pod jasným a fluorescenčním mikroskopem
Vizualizace multiplexní RNA v buňkách pomocí testů ViewRNA FISH
In situ hybridizace divokého typu Drosophila embrya v různých vývojových stádiích pro RNA z genu zvaného hrbáč.

In situ hybridizace (ISH) je typ hybridizace který používá označený komplementární DNA, RNA nebo modifikované vlákno nukleových kyselin (tj. sonda ) k lokalizaci specifické sekvence DNA nebo RNA v části nebo části tkáň (in situ ) nebo pokud je tkáň dostatečně malá (např. semena rostlin, Drosophila embrya), v celé tkáni (celá hora ISH), v buňkách a v cirkulující nádorové buňky (CTC). To se liší od imunohistochemie, který obvykle lokalizuje proteiny v tkáňových řezech.

Hybridizace in situ se používá k odhalení umístění specifických sekvencí nukleových kyselin na chromozomech nebo v tkáních, což je zásadní krok pro pochopení organizace, regulace a funkce genů. Mezi klíčové techniky aktuálně používané patří in situ hybridizace na mRNA s oligonukleotid a sondy RNA (značené radioaktivně i hapteny), analýza pomocí světelných a elektronových mikroskopů, celá montáž in situ hybridizace, dvojitá detekce RNA a RNA plus proteinu a fluorescenční in situ hybridizace k detekci chromozomálních sekvencí. DNA ISH lze použít ke stanovení struktura chromozomů. Fluorescenční DNA ISH (FISH) lze například použít v lékařské diagnostice k hodnocení integrity chromozomů. RNA ISH (RNA in situ hybridizace) se používá k měření a lokalizaci RNA (mRNA, lncRNA a miRNA) v tkáňových řezech, buňkách, celých svazcích a cirkulujících nádorových buňkách (CTC). In situ hybridizaci vynalezl Mary-Lou Pardue a Joseph G. Gall.[1][2][3]

Výzvy hybridizace in situ

Hybridizace in situ je výkonná technika pro identifikaci konkrétních druhů mRNA v jednotlivých buňkách v tkáňových řezech, která poskytuje přehled o fyziologických procesech a patogenezi nemoci. Hybridizace in situ však vyžaduje, aby bylo provedeno mnoho kroků s přesnou optimalizací pro každou vyšetřovanou tkáň a pro každou použitou sondu. Aby se zachovala cílová mRNA v tkáních, je často nutné, aby zesíťující fixační prostředky (jako např formaldehyd ) být použit.

Kromě toho hybridizace in situ na řezech tkáně vyžaduje, aby plátky tkáně byly velmi tenké, obvykle o tloušťce 3 až 7 um. Běžné způsoby přípravy tkáňových řezů pro zpracování in situ hybridizací zahrnují řezání vzorků pomocí kryostatu nebo a Kráječ tkáně Compresstome. A kryostat vezme čerstvou nebo fixovanou tkáň a ponoří ji do kapalného dusíku pro rychlé zmrazení. Poté je tkáň vložena do zmrazovacího média zvaného OCT a tenké řezy jsou nařezány. Mezi překážky patří získání zmrazených artefaktů na tkáni, které mohou interferovat se správným barvením mRNA. The Compresstome řezá tkáň na tenké plátky bez procesu zmrazení; volně plovoucí části jsou po stabilitě vyříznuty po vložení do agarózy. Tato metoda zabraňuje zamrznutí tkáně a tím souvisejících zmrazovacích artefaktů. Proces je trvalý a po dokončení nevratný.

Proces

Pro hybridizaci histochemie, vzorky buněk a tkání jsou obvykle ošetřeny za účelem fixace cílových transkriptů na místě a pro zvýšení přístupu k sondě. Jak je uvedeno výše, sonda je buď označená komplementární DNA nebo nyní nejčastěji doplňkové RNA (riboprobe ). Sonda hybridizuje na cílovou sekvenci při zvýšené teplotě a poté je přebytečná sonda odplavena (po předchozí hydrolýze pomocí RNázy v případě nehybridizované přebytečné sondy RNA). S parametry roztoku, jako je teplota, sůl a / nebo koncentrace detergentu, lze manipulovat, aby se odstranily jakékoli neidentické interakce (tj. Zůstanou vázány pouze přesné shody sekvence). Poté byla sonda, která byla značena buď radioaktivně, fluorescenčně nebo antigenem značenými bázemi (např. digoxigenin ) je lokalizován a kvantifikován ve tkáni za použití buď autoradiografie, fluorescenční mikroskopie nebo imunohistochemie, resp. ISH může také použít dvě nebo více sond označených radioaktivitou nebo jiné neradioaktivní značky k současné detekci dvou nebo více přepisů.

Alternativní technologie, rozvětvený test DNA, lze použít pro RNA (mRNA, lncRNA a miRNA) in situ hybridizační testy s citlivostí na jednu molekulu bez použití radioaktivity. Tento přístup (např. Testy ViewRNA) lze použít k vizualizaci až čtyř cílů v jednom testu a využívá patentovaný design sondy a amplifikaci signálu bDNA ke generování citlivých a specifických signálů. Vzorky (buňky, tkáně a CTC) jsou zafixovány a poté zpracovány, aby byla umožněna přístupnost cíle RNA (nemaskování RNA). Cílové specifické sondy hybridizují s každou cílovou RNA. Následná amplifikace signálu je založena na specifické hybridizaci sousedních sond (individuální oligonukleotidy [oligos], které se vážou vedle sebe na RNA cíle). Typická sonda specifická pro cíl bude obsahovat 40 oligonukleotidů, což má za následek 20 párů oligo, které se vážou vedle sebe na cíl pro detekci mRNA a lncRNA, a 2 oliga nebo jeden pár pro detekci miRNA. Zesílení signálu je dosaženo řadou kroků postupné hybridizace. Molekula pre-zesilovače hybridizuje s každým oligo párem na cílově specifické RNA, poté hybridizuje více molekul zesilovače s každým pre-zesilovačem. Dále více oligonukleotidů značené sondy (konjugovaných s alkalickou fosfatázou nebo přímo s fluorofory) hybridizuje s každou molekulou zesilovače. Plně sestavená struktura zesílení signálu „Strom“ má 400 vazebných míst pro značkovací sondy. Když se všechny cílové specifické sondy vážou na cílový transkript mRNA, dojde k 8 000násobné amplifikaci signálu pro tento jeden transkript. Samostatné, ale kompatibilní systémy zesílení signálu umožňují multiplexní testy. Signál lze vizualizovat pomocí fluorescenčního nebo jasného mikroskopu.

Základní kroky pro sondy značené digoxigeninem

  1. permeabilizace buněk s proteináza K. k otevření buněčných membrán (přibližně 25 minut, není nutné pro tkáňové řezy nebo některá embrya v rané fázi)
  2. vazba mRNA na značenou sondu RNA (obvykle přes noc)
  3. vazba protilátka-fosfatáza na sondu RNA (několik hodin)
  4. barvení protilátky (např. alkalickou fosfatázou)

Protokol trvá přibližně 2–3 dny a nastavení trvá nějakou dobu. Některé společnosti prodávají roboty za účelem automatizace procesu (např. Intavis InsituPro VSi ). Výsledkem je, že v laboratořích byly prováděny rozsáhlé screeningy na tisíce genů. K výsledkům lze obvykle přistupovat prostřednictvím webových stránek (viz externí odkazy).

Viz také

Reference

  1. ^ O'Connor, Clare. „Fluorescence in situ hybridizace (FISH)“. Přírodní výchova.
  2. ^ Gall, JG; Pardue, ML (Červen 1969). „Tvorba a detekce hybridních molekul RNA-DNA v cytologických přípravcích“. Sborník Národní akademie věd Spojených států amerických. 63 (2): 378–83. Bibcode:1969PNAS ... 63..378G. doi:10.1073 / pnas.63.2.378. PMC  223575. PMID  4895535.
  3. ^ Galle, Joe. „Cena Alberta Laskera za speciální výsledky v lékařské vědě“. Laskerova nadace.
  1. Jin, L; Lloyd, RV (1997). „In situ hybridizace: metody a aplikace“. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 11 (1): 2–9. doi:10.1002 / (SICI) 1098-2825 (1997) 11: 1 <2 :: AID-JCLA2> 3.0.CO; 2-F. PMC  6760707. PMID  9021518.
  2. Komplexní a anotovaná in situ hybridizační histochemie
  3. Sekvenování RNA pankreatických cirkulujících nádorových buněk implikuje WNT signalizaci v metastázách
  4. Místní transkriptom v synaptickém neuropilu odhalen hlubokým sekvenováním a zobrazováním ve vysokém rozlišení

externí odkazy